JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

Published: October 19, 2019
doi:
10.3791/60031
, , ,
1School of Life Sciences,The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences, Shenzhen

Summary

בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור לימוד neurite מוצלח בנוירונים הקליפת המוח העובריים על ידי שיתוף הפעולה עם egfp ואת חלבון הריבית.

Abstract

Neurite מוצלח הוא אירוע בסיסי בהקמת מעגלים עצביים במהלך פיתוח מערכת העצבים. נזק neurite חמור ותפקוד סינפטית להתרחש במחלות ניווניות שונות ניוון הקשורות לגיל. חקירת מנגנוני הווסת neurite מוצלח לא רק לשפוך אור יקר על תהליכים התפתחותיים במוח אלא גם על הפרעות נוירולוגיות כאלה. בשל יעילות ההתפתחות הנמוכה, הוא כרגע מאתגר ללמוד את ההשפעה של חלבון מסוים על neurite מוצלח בנוירונים היונקים העיקריים. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לחקירה של neurite מוצלח ידי שיתוף ההתפתחות של נוירונים בקליפת המוח הראשי עם egfp וחלבון של עניין (פוי). שיטה זו מאפשרת זיהוי של הנוירונים מנוכר פוי באמצעות אות egfp, ובכך את ההשפעה של פוי על neurite מוצלח ניתן לקבוע בדיוק. זה מבוסס EGFP מספק גישה נוחה לחקירה של מסלולים ויסות neurite outgrowth.

Introduction

Neurites, כולל אקסונים ו דנדריטים, הם התחזיות מפני נוירונים המעורבים בהקמת רשתות עצביות. הצמיחה הדינמית של neurites היא חיונית עבור פיתוח נוירולוגי. עם זאת, מנגנוני הרגולציה הבסיסיים שמתחת נותרים ברורים. בפרט, נזק neurite הוא נצפה לעתים קרובות במחלות ניווניות שונים ואחרי פציעות המוח1. לכן, חקירת התפקידים של מולקולות neurite מוצלח מסלולים שונים הרגולציה ישפר את הבנתנו את התהליך. יתר על כן, זה עשוי לחשוף מטרות טיפוליות הרומן עבור הפרעות נוירולוגיות שונות. קווי התאים העצביים הם מודלים יקרי ערך עבור לימוד תהליכים עצביים כולל neurite מוצלח כפי שהם קל לתמרן ו transfect2,3. עם זאת, הסחף גנטי דווח להתרחש כמה קווי התאים הנפוצים, אשר יכול להוביל וריאציות התגובות הפיסיולוגיים שלהם4. יתר על כן, ביטוי החלבון הדיפרנציאלי הוכח בין קווי התאים העצביים והנוירונים הראשוניים. למשל, PC12, קו של תא עצבי שנגזר בלוטת יותרת הכליה חולדה המשמשת רבות ללימוד neurite מוצלח2,3, אינו מבטא קולטנים NMDA5. יתר על כן, זה כבר הציע כי התגובה מופחתת של העכבר שורה נוירובלסטומה בקווים עצביים-2a כדי נוירוטוקסינים בהשוואה לנוירונים הראשי הוא בשל חוסר ביטוי של קולטני קרום מסוימים וערוצי יון6. לכן, הנוירונים העיקריים הם מודל רצוי יותר ומייצג לחקירה של neurite outgrowth. עם זאת, השימוש בנוירונים הראשי מפריע היעילות שלהם הזיהום הנמוך7.

כאן, אנו מתארים שיטה המערבת שיתוף הזיהום של חלבון הריבית (פוי) ו-EGFP לנוירונים הראשי הקליפת העור הפנים. ה-EGFP משמש כסמן מורפולוגי לזיהוי נוירונים שעברו בהצלחה ומאפשר את המדידה של neurites. אנו אימות שיטה זו באמצעות תרכובות/מולקולות שדווחו לווסת neurite outgrowth. יתר על כן, FE65, חלבון מתאם עצבי כי הוכח לעורר neurite outgrowth, שימש כדי להמחיש את הגישה הזאת8,9. פרוטוקול זה כולל (1) בידוד של נוירונים בקליפת העור העיקרי מן היום העובריים 18 (E18) עוברי חולדה, (2) את שיתוף הפעולה של נוירונים עם EGFP ואת פוי (FE65 במחקר זה) ו (3) הדמיה וניתוח של הנוירונים באמצעות עיבוד תמונה ImageJ של תוכנה עם תוסף עצבי10,11.

Protocol

כל ההליכים שלאחר מכן היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת האתיקה של הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הסינית בהונג קונג. 1. הכנת שוברי כיסוי מניחים כיסוי סטרילי מעגלי 18 מ”מ לתוך כל טוב של לוחית 12-היטב הרקמה רקמות. לחלוק את הסרבל עם 5 μg/mL פולי-D-ליזין פתרון מחולל 37 מעלו…

Representative Results

כדי לבדוק מתודולוגיה זו, השתמשנו cyto D ואת גורם הגדילה העצבי ngf, אשר הוכחו לעכב ולעורר neurite מוצלח בהתאמה14,15,16. אורך neurite של נוירונים מנוכר עם EGFP נמדדו לאחר הטיפול עם Cyto D או NGF. היעילות של התרגום של EGFP לנוירונים הייתה 2.7% (1,068 נוי…

Discussion

כפי שצוין לפני, PC12 ושיבוטים שלה הם מועסקים נרחב ללמוד הארכה neurite כי יש להם יעילותמעולהמעבר 2,3. לעומת זאת, נוירונים ראשוניים יש שיעור מעבר נמוך, שהוא מכשול גדול ללמוד neurite מוצלח הרגולטורים על ידי התפתחות7. כאן, אנו מתארים פרוטוקול נוח לכמת neurite מוצל…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי כספים מן המועצה מענקים מחקר הונג קונג, בריאות ומחקר רפואי הקרן (הונג קונג), CUHK מענק הערכה, קרן הנאמנות של המכללה המאוחדת ו TUYF נאמנות צדקה.

Materials

#5 tweezers Regine 5-COB
18 mm Circle Cover Slips Thermo Scientific CB00180RA Sterilize before use.
B27 Supplement Gibco 17504044
Cytochalasin D Invitrogen PHZ1063 Dissolved in DMSO.
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Dissecting Scissors, 10 cm World Precision Instruments 14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm World Precision Instruments 15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Fluorescence Mounting Medium Dako S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Neurobasal Medium Gibco 21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein Gibco 13257019
Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip World Precision Instruments 504489
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
pEGFP-C1 Clontech #6084-1
pCI FE65 Please see references 8 and 15
PBS Tablets Gibco 18912014
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7280
Spatula Sigma-Aldrich S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
  2. Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
  3. Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
  4. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  5. Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  8. Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
  9. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  12. Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
  13. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
  14. Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
  15. Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
  16. Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
  17. Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
  18. Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
  19. Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
  20. Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
  21. He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
  22. Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)–soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
  23. Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
  24. Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).
  25. Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
  26. Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
  27. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  28. Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
  29. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
  30. Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
  31. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  32. Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).

Tags

EGFPNeurite OutgrowthPrimary NeuronsTransfectionNeural RegenerationBrain TraumaNeurodegenerative DiseasesPoly-D-LysineSprague Dawley RatCerebral HemispheresCortexTrypsin EDTAMaintenance Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chan, W. W. R., Li, W., Chau, D. L. D., Lau, K. An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (152), e60031, doi:10.3791/60031 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image