Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários
Summary
Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.
Abstract
O conseqüência do neurite é um evento fundamental na formação dos circuitos neural durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Dano de neurite severo e disfunção sináptica ocorrem em várias doenças neurodegenerativas e degeneração relacionada à idade. A investigação dos mecanismos que regulam o conseqüência do neurite não somente derramaria a luz valiosa em processos desenvolventes do cérebro mas igualmente em tais desordens neurológicas. Devido à baixa eficiência do transfection, é atualmente desafiante estudar o efeito de uma proteína específica no conseqüência do neurite em neurônios mamíferos preliminares. Aqui, nós descrevemos um método simples para a investigação do conseqüência do neurite pelo co-transfection de neurônios corticais do rato preliminar com EGFP e uma proteína do interesse (POI). Este método permite a identificação de neurônios transfected do POI através do sinal de EGFP, e assim o efeito do POI no conseqüência do neurite pode ser determinado precisamente. Este ensaio baseado em EGFP fornece uma aproximação conveniente para a investigação dos caminhos que regulam o outgrowth do neurite.
Introduction
Neurites, incluindo os axônios e dendritos, são as projeções de neurônios envolvidos no estabelecimento das redes neurais. O crescimento dinâmico dos neuritos é essencial para o neurodesenvolvimento. No entanto, os mecanismos regulamentares subjacentes permanecem pouco claros. Em particular, o dano de neurite é freqüentemente observado em várias doenças neurodegenerativas e após lesões cerebrais1. Portanto, a investigação dos papéis de moléculas putativas em várias vias regulatórias de crescimento de neurite melhoraria nossa compreensão do processo. Além disso, pode revelar alvos terapêuticos novos para várias desordens neurológicas. As linhas celulares neuronais são modelos valiosos para estudar processos neuronais, incluindo o crescimento de neurite, pois são fáceis de manipular e transfecção2,3. No entanto, a deriva genética tem sido relatada a ocorrer em algumas linhas celulares comumente usadas, o que pode levar a variações em suas respostas fisiológicas4. Além disso, a expressão diferencial da proteína foi mostrada entre linhas de pilha neuronal e neurônios preliminares. Por exemplo,PC12, umalinha celular neuronal derivada da glândula adrenal do rato que é amplamente utilizada para estudar o conseqüência do neurite2,3, nãoexpressa receptores NMDA5. Além disso, tem sido proposto que a responsividade reduzida da linha neuro-2a neuroblastoma mouse para neurotoxinas em comparação com os neurônios primários é devido à falta de expressão de certos receptores de membrana e canais iônicos6. Conseqüentemente, os neurônios preliminares são um modelo mais desejável e representativo para a investigação do outgrowth do neurite. No entanto, o uso de neurônios primários é dificultado pela sua baixa eficiência de transfecção7.
Aqui, nós descrevemos um método que envolva o co-Transfection da proteína do interesse (POI) e do EGFP aos neurônios corticais principais do rato. O EGFP atua como um marcador morfológico para a identificação de neurônios transfectados com sucesso e permite a mensuração de neuritos. Nós validamos este método usando compostos/moléculas que foram relatadas para modular o outgrowth do neurite. Além disso, FE65, uma proteína do adaptador neuronal que seja mostrada para estimular o outgrowth do neurite, foi usada para ilustrar esta aproximação8,9. Este protocolo envolve (1) o isolamento de neurônios corticais primários de embriões de ratos do dia embrionário 18 (E18), (2) a cotransfecção de neurônios com EGFP e o POI (FE65 neste estudo) e (3) a imagem e análise dos neurônios usando o processamento de imagens software ImageJ com o plugin NeuronJ10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como afirmado antes, PC12 e seus subclones são amplamente empregados para estudar a extensão do neurite, pois têm excelente eficiênciadetransfecção 2,3. Em contrapartida, os neurônios primários têm uma baixa taxa de transfecção, que é um grande obstáculo para o estudo dos reguladores de crescimento do neurite por transfecção7. Aqui, nós descrevemos um protocolo conveniente para quantificar o conseqüência do neurite em neu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos do Conselho de auxílios de pesquisa de Hong Kong, saúde e fundo de investigação médica (Hong Kong), regime de subvenção direta da faculdade de administração, o fundo de dotação da United College e o TUYF caridade fiduciário.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
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