Un meilleur assougo de fluorescence verte à base de protéines pour étudier la croissance de la neurite dans les neurones primaires
Summary
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole simple pour étudier la croissance neurite dans les neurones corticaux embryonnaires de rat en co-transfectant avec l’EGFP et la protéine d’intérêt.
Abstract
La croissance neurite est un événement fondamental dans la formation des circuits neuronaux pendant le développement du système nerveux. Les dommages graves de neurite et le dysfonctionnement synaptique se produisent dans diverses maladies neurodegenerative et dégénérescence relative à l’âge. L’étude des mécanismes qui règlent la croissance de neurite jetterait non seulement la lumière valable sur des processus développementals de cerveau mais également sur de tels désordres neurologiques. En raison de la faible efficacité de transfection, il est actuellement difficile d’étudier l’effet d’une protéine spécifique sur la croissance neurite chez les neurones mammifères primaires. Ici, nous décrivons une méthode simple pour l’étude de la croissance de neurite par la co-transfection des neurones corticaux primaires de rat avec EGFP et une protéine d’intérêt (POI). Cette méthode permet d’identifier les neurones transfectés POI par le signal EGFP, et ainsi l’effet de l’IPI sur la croissance neurite peut être déterminé avec précision. Cet exemple d’EGFP fournit une approche pratique pour l’étude des voies régulant la croissance neurite.
Introduction
Les neurites, y compris les axones et les dendrites, sont les projections des neurones impliqués dans l’établissement des réseaux neuronaux. La croissance dynamique des neurites est essentielle au neurodéveloppement. Cependant, les mécanismes de réglementation sous-jacents restent flous. En particulier, des dommages de neurite sont souvent observés dans diverses maladies neurodegenerative et après des dommages de cerveau1. Par conséquent, l’étude des rôles des molécules putatives dans diverses voies réglementaires de croissance neurite améliorerait notre compréhension du processus. En outre, il peut révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour divers désordres neurologiques. Les lignées cellulaires neuronales sont des modèles précieux pour l’étude des processus neuronaux, y compris la croissance neurite car ils sont faciles à manipuler et transfect2,3. Cependant, la dérive génétique a été rapportée pour se produire dans quelques lignées de cellules couramment utilisées, qui pourraient mener aux variations dans leurs réponses physiologiques4. En outre, l’expression différentielle de protéine a été montrée entre des lignes neuronales de cellules et des neurones primaires. Par exemple, PC12, une lignée cellulaire neuronale dérivée de la glande surrénale rat qui est largement utilisé pour étudier la croissance neurite2,3, n’exprime pas les récepteurs NMDA5. En outre, il a été proposé que la réactivité réduite de la ligne de neuroblastome de souris neuro-2a aux neurotoxines par rapport aux neurones primaires est due au manque d’expression de certains récepteurs de membrane et canaux d’ion6. Par conséquent, les neurones primaires sont un modèle plus souhaitable et représentatif pour l’étude de la croissance neurite. Cependant, l’utilisation des neurones primaires est entravée par leur faible efficacité de transfection7.
Ici, nous décrivons une méthode qui implique la co-transfection de la protéine d’intérêt (POI) et de l’EGFP aux neurones corticaux primaires de rat. L’EGFP agit comme un marqueur morphologique pour l’identification des neurones transfectés avec succès et permet de mesurer les neurites. Nous avons validé cette méthode en utilisant des composés/molécules qui ont été rapportés pour moduler la croissance de neurite. En outre, FE65, une protéine adaptatrice neuronale qui a été montrée pour stimuler la croissance neurite, a été employée pour illustrer cette approche8,9. Ce protocole implique (1) l’isolement des neurones corticaux primaires des embryons embryonnaires de rat 18 (E18), (2) la co-transfection des neurones avec EGFP et le POI (FE65 dans cette étude) et (3) l’imagerie et l’analyse des neurones en utilisant le traitement de l’image logiciel ImageJ avec le plugin NeuronJ10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme indiqué précédemment, PC12 et ses sous-clones sont largement utilisés pour étudier l’extension de neurite parce qu’ils ont une excellente efficacité de transfection2,3. En revanche, les neurones primaires ont un faible taux de transfection, qui est un obstacle majeur pour l’étude des régulateurs de croissance neurite par transfection7. Ici, nous décrivons un protocole commode pour quantifier la croissance de neurite dans les…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds du Research Grants Council Hong Kong, du Health and Medical Research Fund (Hong Kong), du programme de subventions directes de la CUHK, du fonds de dotation du United College et du TUYF Charitable Trust.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
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