Улучшенный зеленый флуоресценции белка основе Анализ для изучения Neurite Outgrowth в первичных нейронов
Summary
В этом отчете мы описываем простой протокол для изучения невритовых наростов эмбриональных крысиных корковых нейронов путем совместного перевода с EGFP и белка, интересующего.
Abstract
Невритный рост является фундаментальным событием в формировании нейронных цепей при развитии нервной системы. Тяжелые повреждения неврита и синаптической дисфункции происходят при различных нейродегенеративных заболеваниях и возрастной дегенерации. Исследование механизмов, которые регулируют невритный рост будет не только пролить ценный свет на процессы развития мозга, но и на такие неврологические расстройства. Из-за низкой эффективности трансфекции, в настоящее время сложно изучить влияние конкретного белка на нейрит нарост в первичных нейронов млекопитающих. Здесь мы описываем простой метод исследования невритовых наростов путем со-трансфекции первичных крысиных корковых нейронов с EGFP и белка, представляющих интерес (POI). Этот метод позволяет идентифицировать POI трансинфицированных нейронов через сигнал EGFP, и, таким образом, влияние POI на неврит рост может быть определена точно. Этот результат на основе EGFP обеспечивает удобный подход для исследования путей, регулирующих неврит.
Introduction
Нейриты, включая аксоны и дендриты, являются проекциями нейронов, участвующих в создании нейронных сетей. Динамический рост невритов необходим для нейроразвития. Однако основные механизмы регулирования, лежащие в основе, остаются неясными. В частности, повреждение неврита часто наблюдается при различных нейродегенеративных заболеваниях и после травм головного мозга1. Таким образом, исследование роли индикативных молекул в различных невритовых путях роста улучшило бы наше понимание процесса. Кроме того, он может выявить новые терапевтические цели для различных неврологических расстройств. Нейронные клеточные линии являются ценными моделями для изучения нейронных процессов, включая невритовый рост, поскольку они легко манипулировать и трансфекта2,3. Тем не менее, генетический дрейф, как сообщается, происходит в некоторых широко используемых клеточных линий, которые могут привести к изменениям в их физиологических реакций4. Кроме того, дифференциальная экспрессия белка была показана между нейрональными клеточными линиями и первичными нейронами. Например, PC12, нейрональной линии клеток, полученных из крыс надпочечников, которая широко используется для изучения неврит овых2,3, не выражает NMDA рецепторов5. Кроме того, было предложено, что снижение отзывчивости линии нейробластомы мыши нейробластомы нейро-2а к нейротоксинам по сравнению с первичными нейронами связано с отсутствием экспрессии определенных мембранных рецепторов и ионных каналов6. Таким образом, первичные нейроны являются более желательной и репрезентативной моделью для исследования невритовых наростов. Тем не менее, использование первичных нейронов препятствует их низкой эффективностью трансфекции7.
Здесь мы описываем метод, который включает в себя совместное трансфекцию белка, представляющих интерес (POI) и EGFP для первичных крыс корковых нейронов. EGFP действует как морфологический маркер для идентификации успешно трансинфицированных нейронов и позволяет измерять невриты. Мы подтвердили этот метод с помощью соединений / молекул, которые, как сообщается, модулировать неврит нарастания. Кроме того, FE65, нейрональный адаптер белка, который, как было показано, стимулировать неврит нарост, был использован, чтобы проиллюстрировать этот подход8,9. Этот протокол включает в себя (1) изоляцию первичных корковых нейронов от эмбриональных эмбрионов 18 (E18) крысиных эмбрионов, (2) совместное трансфекцию нейронов с EGFP и POI (FE65 в данном исследовании) и (3) визуализацию и анализ нейронов с помощью обработки изображений программное обеспечение ImageJ с плагином NeuronJ10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как указывалось ранее, PC12 и его подклоны широко используются для изучения расширения неврита, потому что они имеют отличную эффективность трансфекции2,3. В отличие от этого, первичные нейроны имеют низкий уровень трансфекции, который является основным пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана за счет средств Из Научно-исследовательского совета Гонконга, Фонда медицинских и медицинских исследований (Гонконг), схемы прямых грантов CUHK, Фонда пожертвований Объединенного колледжа и Благотворительного фонда TUYF.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)–soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
