Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias
Summary
En este informe, describimos un protocolo simple para estudiar el crecimiento de neurita en neuronas corticales de rata embrionaria mediante la co-transfección con EGFP y la proteína de interés.
Abstract
El crecimiento de neurita es un evento fundamental en la formación de los circuitos neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso. El daño grave a la neurita y la disfunción sináptica ocurren en diversas enfermedades neurodegenerativas y en la degeneración relacionada con la edad. La investigación de los mecanismos que regulan el crecimiento de las neuritas no sólo arrojaría una valiosa luz sobre los procesos de desarrollo cerebral, sino también sobre estos trastornos neurológicos. Debido a la baja eficiencia de transfección, actualmente es difícil estudiar el efecto de una proteína específica en el crecimiento de neurita en las neuronas primarias de mamíferos. Aquí, describimos un método simple para la investigación del crecimiento de neurita por la co-transfección de neuronas corticales de rata primaria con EGFP y una proteína de interés (POI). Este método permite la identificación de las neuronas transfectó el PDI a través de la señal EGFP, y por lo tanto el efecto del PDI en el crecimiento de neurita se puede determinar con precisión. Este ensayo basado en el EGFP proporciona un enfoque conveniente para la investigación de vías que regulan el crecimiento de las neuritas.
Introduction
Los neuritas, incluyendo axones y dendritas, son las proyecciones de las neuronas implicadas en el establecimiento de las redes neuronales. El crecimiento dinámico de los neurótesis es esencial para el neurodesarrollo. Sin embargo, los mecanismos reglamentarios subyacentes que hay debajo siguen sin estar claros. En particular, el daño de neurita se observa a menudo en varias enfermedades neurodegenerativas y después de lesiones cerebrales1. Por lo tanto, la investigación de los roles de las moléculas putativas en varias vías reguladoras de crecimiento de neurita mejoraría nuestra comprensión del proceso. Por otra parte, puede revelar nuevas dianas terapéuticas para diversos trastornos neurológicos. Las líneas celulares neuronales son modelos valiosos para estudiar los procesos neuronales, incluido el crecimiento de neurita, ya que son fáciles de manipular y transfectar2,3. Sin embargo, se ha informado que la deriva genética ocurre en algunas líneas celulares de uso común, lo que podría conducir a variaciones en sus respuestas fisiológicas4. Además, se ha demostrado la expresión diferencial de proteínas entre las líneas celulares neuronales y las neuronas primarias. Por ejemplo, PC12, una línea celular neuronal derivada de la glándula suprarrenal de rata que se utiliza ampliamente para el estudio de crecimiento de neurita2,3, no expresa los receptores NMDA5. Además, se ha propuesto que la menor capacidad de respuesta de la línea de neuroblastoma de ratón neuro-2a a las neurotoxinas en comparación con las neuronas primarias se debe a la falta de expresión de ciertos receptores de membrana y canales iónicos6. Por lo tanto, las neuronas primarias son un modelo más deseable y representativo para la investigación del crecimiento de neurita. Sin embargo, el uso de neuronas primarias se ve obstaculizado por su baja eficiencia de transfección7.
Aquí, describimos un método que implica la co-transfección de la proteína de interés (POI) y EGFP a las neuronas corticales de rata primarias. El EGFP actúa como un marcador morfológico para la identificación de las neuronas transpiradas con éxito y permite la medición de neurítos. Validamos este método mediante el uso de compuestos/moléculas que se han informado para modular el crecimiento de neurita. Además, FE65, una proteína adaptadora neuronal que se ha demostrado para estimular el crecimiento de neurita, se utilizó para ilustrar este enfoque8,9. Este protocolo implica (1) el aislamiento de las neuronas corticales primarias de embriones embrionarios embrionarios embrionarios embrionarios del día 18 (E18), (2) la co-transfección de neuronas con EGFP y el PDI (FE65 en este estudio) y (3) la toma de imágenes y el análisis de las neuronas mediante el procesamiento de imágenes software ImageJ con el plugin NeuronJ10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se ha dicho antes, PC12 y sus subclones son ampliamente empleados para el estudio de la extensión de neurita porque tienen una excelente eficiencia de transfección2,3. Por el contrario, las neuronas primarias tienen una baja tasa de transfección, que es un obstáculo importante para el estudio de los reguladores de crecimiento de neurita por transfección7. Aquí, describimos un protocolo conveniente para cuantificar el crecimiento…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Becas de Investigación Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), el esquema de subvenciones directas CUHK, el fondo de dotación de United College y el TUYF Charitable Trust.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
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