JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Настраиваемый подход к ферментативным производством и очистке терепенидов натуральных продуктов

Published: October 04, 2019
doi:
10.3791/59992
, , , , ,
1Department of Plant Biology,University of California Davis

Summary

Здесь мы представляем простой в использовании протоколы для производства и очистки метаболитов дитерпеноидов через комбинаторную экспрессию биосинтетических ферментов в Escherichia coli или Nicotiana benthamiana, за которым следует хроматографический продукт Очистки. Полученные метаболиты подходят для различных исследований, включая молекулярную структуру характеристики, ферментфункциональные исследования и анализы биоактивности.

Abstract

Дитерпеноиды образуют разнообразный класс малых молекул природных продуктов, которые широко распространены по всему царству жизни и имеют критические биологические функции в процессах развития, межорганизмовых взаимодействий и адаптации к окружающей среде. Из-за этих различных биоактивности, многие дитерпеноиды также имеют экономическое значение, как фармацевтические препараты, пищевые добавки, биотопливо и другие биопродукты. Усовершенствованные геномики и биохимические подходы позволили быстро расширить знания о дитерпеноидно-метаболических генах, ферментах и путях. Однако структурная сложность дитерпеноидов и узкое таксономическое распределение отдельных соединений зачастую только одного вида остаются сдерживающими факторами для их эффективного производства. Наличие более широкого спектра метаболических ферментов в настоящее время обеспечивают ресурсы для производства дитерпеноидов в достаточном количестве титеров и чистоты, чтобы облегчить более глубокое исследование этой важной группы метаболитов. Опираясь на установленные инструменты для микробного и растительного коэнзима совместного выражения, мы представляем легко управляемый и настраиваемый протокол для ферментативного производства дитерпенов в либо Escherichia coli или Nicotiana benthamiana, и очистка желаемых продуктов с помощью кремнезема хроматографии и полу-подготовки HPLC. Используя группу кукурузы(Зея май )dolabralexin дитерпенов в качестве примера, мы подчеркиваем, как модульные комбинации дитерпена синтаза (diTPS) и цитохром P450 монооксигеназы (P450) ферменты могут быть использованы для создания различных дитерпеноидных лесах. Очищенные соединения могут быть использованы в различных применениях вниз по течению, таких как метаболит структурный анализ, фермент структуры-функции исследований, а также в пробирке и в экспериментах по биоактивности стоек.

Introduction

Дитерпеноиды составляют химически разнообразную группу из более чем 12 000 преимущественно полициклических 20-углеродных натуральных продуктов, которые играют важную роль во многих организмах1. Грибы и растения производят наибольшее разнообразие дитерпеноидов, но бактерии также были показаны для формирования биологически активных дитерпенов (см. отзывы2,3,4,5). Укорененные в их обширном структурном разнообразии, дитерпеноиды служат множеством биологических функций. Несколько дитерпеноидов, таких как гормоны роста гиббереллина, имеют важные функции в процессах развития5. Однако большинство дитерпеноидов служат посредниками химической защиты и межорганизмовых взаимодействий. Среди них, дитерпен овых риз кислот в вредителей и патогенных защиты хвойных деревьев и видов конкретных смесей антимикробных дитерпенов в основных продовольственных культур, таких каккукуруза (Зея май)и риса (Oryza sativa) были наиболее широко изучали 6,7. Эти биодеятельности обеспечивают богатый химический хранилище для коммерческого применения, и выбрать дитерпеноиды используются в качестве важных фармацевтических препаратов, пищевых добавок, клеев и других биопродуктов повседневной современной жизни8,9 ,10. Для продвижения исследований по естественному разнообразию и биологическим функциям дитерпеноидов и, в конечном счете, содействия более широкому коммерческому применению необходимы инструменты для экономичной подготовки чистых соединений. Крупномасштабная изоляция от растительного материала была установлена для нескольких дитерпеноидных биопродуктов, таких как дитерпеновые кислоты, которые производятся в качестве побочного продукта целлюлозно-бумажной промышленности8. Однако накопление дитерпеноидов только в конкретных тканях и при жестком регулировании экологическими стимулами часто ограничивает изоляцию достаточных объемов продукции от натурального производителя2. Кроме того, структурная сложность дитерпеноидов затрудняет их производство через химический синтез, хотя такие подходы были успешными в нескольких случаях11,12. С наличием передовых геномных и биохимических технологий, ферментативные производственные платформы получили все большее внимание для производства целого ряда дитерпеноидных соединений (см. обзоры13,14, 15,16,17,18).

Все терпеноиды, в том числе дитерпеноиды, являются производными от двух изомерических изопреноидов прекурсоров, изопентенилодий дифосфата (IPP) и диметилаллилдилова дифосфата (DMAPP)19, которые, в свою очередь, образуются через мевалонат (MVA) или метилеритрититол-5-фосфат (MEP) путь. Терпеноидный биосинтез протекает через путь MEP в бактериях и пути MVA в грибах, тогда как заводы обладают цитозолиальной MVA и пластичным пути MEP, при последнем основной путь к образованию дитерпеноидов20. Конденсация IPP и DMAPP пренил-трансферазы дает центральный 20-углеродный предшественник для всех дитерпеноидов, геральгенанил дифосфата (GGPP)20. Вниз по течению формирования GGPP, два фермента семейства, терпене синтаза (TPSs) и цитохром P450 монооксигеназы (P450s) в значительной степени контролировать формирование огромного химического разнообразия терпеноидного метаболизма21,22. Diterpene синтаза (diTPSs) катализировать совершенные карбокации инициативе циклизации и перестановки GGPP для формирования различных стереоспецифических би-, поли-, или макро-циклические дьептена леса1,3,23, 24. Оксигенации и дальнейшего функционального украшения этих лесов затем облегчается P450 ферментов и выбрать другие ферменты семейства22,25. TPSs и P450s обычно существуют как видовые, многогенные семейства, которые могут образовывать модульные биосинтетические сети, где объединение различных ферментных модулей по общему плану позволяет формировать широкий спектр соединений2, 26. Быстрое открытие функционально различных ферментов, работающих в модульных терпеноидных путей в последние годы предоставило расширяющиеся возможности для их использования в качестве универсального списка частей для метаболического проектирования частичных или полных путей в как микробных, так и растительных производственных платформ. Например, дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) был успешно применен для разработки мультиферментных путей для производства терпеноидных биопродуктов, таких как противомалярийный препарат артемизинин27, сесквиторпеноид биотоплива бисаболен и фарнезен28, но и выбрать дитерпеноиды29,30,31. Аналогичным образом, инженерии Escherichia coli платформ для промышленного масштаба производства были созданы для нескольких метаболитов дитерпеноидов, в том числе таксатор таксадин Таксола используется в качестве противоракового препарата и дитерпена алкоголя, скореола , используется в парфюмерной промышленности13,32,33,34. Достижения в области генной инженерии и технологий трансформациитакже сделали системы растительных хост все более жизнеспособными для производства растительных натуральных продуктов9,14,35,36. В частности, близкий табачный родственник, Nicotiana benthamiana, стал широко используемым шасси для терпеноидного анализа пути и проектирования, благодаря простоте Agrobacterium-опосредованнойтрансформации нескольких комбинаций генов , эффективный биосинтез эндогенных прекурсоров, и высокая биомасса14,35,36.

Опираясь на эти установленные платформы для терпеноидного биосинтеза, мы описываем здесь простые в использовании и экономичные методы ферментативного производства дитерпеноидов и очистки отдельных соединений. Представленные протоколы иллюстрируют, как платформы E. coli и N. benthamiana, разработанные для усовершенствованного биосинтеза дитерпеноидов-прекурсоров, могут быть использованы для комбинированного выражения различных диПС и ферментов P450 для генерации желаемых дитерпеноидных соединений. Применение этого протокола для производства и очистки структурно различных дитерпеноидов показано на примере специализированных дитерпеноидов изкукурузы (Зея майс),называют долабралексины, эндогенный биосинтез которых набирает два diTPS и один P450 Фермента. Очистка различных долабралексинов, начиная от олефинов до оксигенированных производных, достигается путем объединения сепараторной воронки с крупномасштабной хроматографией кремнезема и препаративной жидкой хроматографией высокого давления (HPLC). Описанные протоколы оптимизированы для производства дитерпеноидов, но также могут быть легко адаптированы для связанных классов терпеноидов, а также других натуральных продуктов, для которых доступны ферментные ресурсы. Соединения, производимые с использованием этого подхода, подходят для различных приложений, включая, но не ограничиваясь, структурную характеристику с помощью анализа ядерного магнитного резонанса (ЯМР), использовать в качестве субстратов для функциональных исследований ферментов, а также ряд анализы биоактивности.

Protocol

ВНИМАНИЕ: Описанные здесь протоколы включают использование опасных химических веществ, острых предметов, электрических устройств, горячих объектов и других опасностей, которые могут привести к травмам. Следует носить соответствующее средства индивидуальной защиты и соблюдать надлежащие процедуры безопасности, включая тренинги по технике безопасности. 1. Подготовка материалов и решений Подготовка и автоклавный лизогенный бульон среды (LB) в течение 30 мин: На 1 л среднего, смешать 10 г триптона, 5 г экстракта бактериальных дрожжей, и 10 г NaCl и растворить в 1 л деионизированной (DI) воды. Для 1 L совместного выражения культур, подготовить и автоклав Потрясающий бульон (ТБ) среды для 30 мин: В 2,8 л Erlenmeyer колба смесь 12 г триптона, 24 г бактериального экстракта дрожжей, и 40 мл 10% (v/v) глицерол и растворить в 860 мл воды DI. Подготовка и автоклав 1,3 л 10-х фосфатного буфера No1,3 л воды DI, 30,03 г монопотильного фосфата (KH2PO4)и 163,02 г фосфата диполотиума (K2HPO4)и добавьте к вышеупомянутой среде. Подготовка Супер Оптимальный бульон с Катаболит репрессии (SOC) СМИ. Подготовка и автоклав в течение 30 мин раствор, содержащий 2% (w/v) триптон, 0,5% (w/v) экстракт бактериальных дрожжей, 8,5 мМ NaCl, и 2,5 мм KCl. Добавьте стерильные MgSO4 и глюкозу с конечной концентрацией 20 мМ. Используйте 1 M NaOH для адаптации к рН 7.0. Храните медианое хранилище SOC при -20 градусов по Цельсию. Приготовьте 1 л из 1 М пирувата натрия. Автоклав в течение 15 минут и хранить при 4 градусах Цельсия. Приготовьте 20 мл изопропила Д-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в стерильной воде DI. Храните 1-2 мл aliquots при -20 градусах по Цельсию. Подготовьте инфильтрационный буфер: 10 мМ МЧС (1,952 г) и 10 мМ MgCl2 (2,033 г) растворяется в 1 л воды DI. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Подготовка и автоклав LB агар в течение 30 мин: На 100 мл воды DI, добавить 1 г триптона, 0,5 г экстракта бактериальных дрожжей, 1 г NaCl, и 1,5 г агара. После того, как LB агар достаточно прохладно, чтобы справиться с бутылкой, добавить антибиотики, как это требуется для желаемых комбинаций плазмида. Налейте агар тарелки с помощью чашки Петри и хранить при 4 градусах Цельсия. См Таблица 1 для спецификаций в отношении производства соединений в кишечной палочки и Н. benthamiana, соответственно. Оберните пластины, содержащие рифампицин в фольге, чтобы предотвратить деградацию при хранении. Рабочая концентрация (мкг/мл) Антибиотик Сток (мг/мл) Растворителя 1 плазмида 2 плазмиды 3 или 4 плазмиды Карбенициллин 50 H2O 50 25 20 Хлорамфеникол 30 EtOH 30 20 20 Канамыцин 50 H2O 50 25 20 Спектриномицин 30 H2O 30 25 20 Гентамицина 50 H2O 30 Рифампицин 10 MeOH 10 Таблица 1: Концентрация антибиотиков для коэкспрессии плазмида в кишечной палочке или Н. бентамиане. 2. Производство метаболитов дитерпеноидов в кишечной палочке ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь для производства метаболитов дитерпеноидов в кишечной палочке, был адаптирован из ранее зарегистрированной ферментной платформы совместного выражения, разработанной группой д-ра Рубена Дж. Петерса (Университет штата Айова, IA, США)13 ,32. Преобразование компетентных клеток с плазмидными комбинациями. В этом протоколе использовались химически компетентные клетки кишечной палочки (клетки BL21DE3-C41). Добавьте 1 кЛ раствора по 100 нг/л каждой конструкции, используемой для совместного выражения, до 25 мл компетентных клеток в микротрубке мощностью 1,5 мл. Не вихрь или смешивать путем pipetting.ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной экспрессии и активности ферментов TPS и P450 необходимо учитывать несколько изменений последовательности. Для TPS, удаление N-терминала пластидиального транзитного пептида часто имеет важное значение. В частности, пластидиальный моно- и ди-TPS обычно требуют удаления прогнозируемого транзитного пептида (с использованием общих алгоритмов прогнозирования37),в то время как цитозолические сески-TPS обычно могут быть использованы в качестве полноразмерных генов. Что касается P450s, оптимизация кодона, а также удаление или замена с лидером последовательности MAKKTSSKGK N-терминал трансмембранного домена доказал свою эффективность во многих случаях38,39. Кроме того, при совместном выражении ферментов P450 следует включать цитохромную редуктазу P450 (CPR), чтобы обеспечить достаточную активность P450. Инкубировать смесь на льду в течение 30 мин. Смешайте каждые 10 минут, аккуратно соскребая трубку через стойку микротрубки. Предварительно инкубируйте SOC-носители и пластины LB agar при 37 градусах Цельсия, содержащие антибиотики, как это требуется для желаемого сочетания конструкций.ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая конструкция, которая будет совместно преобразована должны иметь различные устойчивости к антибиотикам, а также различные истоки репликации для обеспечения оптимального экспрессии белка. Тепло шокирует клеточную смесь при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 1 минуты, а затем инкубировать на льду в течение по крайней мере 2 мин. Добавьте 200 л теплых носителей SOC. Встряхните клеточную смесь на 1 ч при 37 градусах Цельсия и 200 об/мин. Добавьте около 10 автоматических стеклянных шариков к подогретой пластине агара LB. Добавьте 100 кл/л клеточной смеси и замените крышку. Встряхните пластину горизонтально с крышкой, чтобы равномерно распределить клетки. Удалите стеклянные бусы, выстукивая их в контейнер для отходов. Кроме того, используйте другие предпочтительные методы покрытия. Инкубировать пластину LB агар агар на 37 градусов по Цельсию на ночь с покрытием поверхности вниз. Пластина с преобразованными колониями кишечной палочки может быть использована на следующий день или храниться при 4 градусах Цельсия, запечатанных в парафина пленку на срок до 2 недель. Подготовка прививочной культуры На следующий день подготовьте раствор среды LB с антибиотиками, необходимыми для преобразованной плазмидной комбинации, используя концентрации, предусмотренные в таблице 1. В стерильных капюшонах, передача 5 мл LB среды в 15 мл стерильной стеклянной пробирке с пластиковой дышащий крышкой. Подготовьте одну небольшую культурную трубку для каждой желаемой большой (1 л) культуры. Выберите отдельные колонии кишечной палочки из пластины агара LB с помощью наконечника пипетки. Прививать каждую трубку LB с колонией кишечной палочки, выбрасывая один кончик пипетки, содержащий выбранную колонию в каждую трубку. Cap каждой прививки культуры пробирки с дышащий пластиковой крышкой. Поместите ограниченный E. coli малых культур в 37 градусов по Цельсию встряхивания инкубатор для 12-24 ч. Подготовка и индукция культур совместного выражения На следующий день добавьте 100 мл подготовленного 10-х фосфатного буфера в 900 мл подготовленного ТБ для конечной концентрации фосфатного буфера в 1x. Добавить необходимые антибиотики с концентрациями в соответствии с таблицей 1. Встряхните при 140 об/мин при 37 градусах По Цельсию до теплой (примерно 30 мин). Прививать каждую колбу средств массовой информации для 1 L культур с 5 мл прививки культуры. Сохранить пипетку наконечник, используемый для прививки культуры прививки в прививки культуры трубки так, что при извлечении с органическим растворителем в последующих шагах, Есть нет извлеченных пластиковых загрязняющих веществ. Инкубировать с тряской при 200 об/мин до тех пор, пока оптическая плотность при 600 Нм (OD600) не достигнет 0,6, примерно 3 ч. Для измерения OD600 с помощью спектрофотометра используйте смесь стерильного туберкулеза с фосфатным буфером в качестве заготовки. При желаемом OD600установите настройки инкубатора до 16 градусов по Цельсию. При совместном выражении P450s, свежеприготовленные рибофлавин и аминолевулиновая кислота, которые необходимы для достаточного производства p450 ко-фактора. Для каждого эксперимента выражайте 4 г/л рибофлавина и 150 г/л аминолевулиновой кислоты. Держите раствор завернутый в фольгу до использования, как рибофлавин светочувствительный. После того, как инкубатор достиг 16 градусов по Цельсию (примерно 30 мин), добавьте 1 мл 1 МПтГ, 1 мл 4 г/л рибофлавина и 1 мл 150 г/л аминолевулиновой кислоты для каждой культуры. Для производства дитерпеноидов, 25 мл 1 М пируват натрия должны быть добавлены к каждой культуре, чтобы обеспечить достаточное образование прекурсоров.ПРИМЕЧАНИЕ: Все конструкции, используемые в этом ассее, находились под тем же стимулом Для IPTG. Различные промоутеры могут быть использованы по желанию. Инкубировать при 16 градусах Цельсия и 140 об/мин при 72 ч. Добавить 25 мл пирувата натрия каждый последующий день после индукции при производстве дитерпеноидов. Немедленное использование культур немедленно используются для сепараторной воронки извлечения метаболитов; не собирают и не хранят культуры. 3. Разделение и очищение метаболитов Извлечение сепараторной воронки метаболитовПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать только стеклянную посуду и стеклянные пипетки при использовании органических растворителей для предотвращения загрязнения пластификатора. В дым капюшон, закрепите сепараторной воронки на кольцо стенда. Поместите мусорный стакан под сепараторную воронку. Налейте 500 мл 50/50 (v/v) этиловый ацетат/гексаны в сепараторную воронку.ПРИМЕЧАНИЕ: Растворительная смесь должна быть скорректирована на основе растворимости и полярности целевых метаболитов. Для обеспечения надлежащего поэтапного разделения следует избегать растворителей, связанных с водой. Добавьте 500 мл культуры кишечной палочки в сепараторную воронку и поместите на стеклянную пробку. Встряхните воронку, чтобы смешать культуру с растворителем добычи, примерно в 5-10 раз. Часто де-газ воронки, открыв кран в то время как воронка удерживается вверх дном и указал на дым капот, чтобы освободить давление. Повторите встряхивания и де-газ процедуры 2x. Поместите воронку вертикально в кольцо стенда и ждать, пока растворитель слоя (сверху) отделяется от водной (культуры) слой (внизу), примерно 1 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Когда большое количество пузырьков наблюдается в межфазе, добавление небольшого объема 5-10 мл EtOH может быть добавлено для улучшения фазового разделения. Удалите пробку. Слейте слой кишечной палочки в мусорный стакан, удерживая растворительный слой в воронке. Повторите процедуру, используя оставшиеся 500 мл культуры кишечной палочки и тот же 500 мл растворителя, используемого для первой добычи. Слейте растворитель, содержащий извлеченные метаболиты, в чистую колбу. Избегайте загрязнения с e. coli культуры. Концентрация ротарного испарения Приготовьте вращающееся испарение (ротовап) оборудование: заполните водяную баню и установите температуру до 25 градусов по Цельсию. Для теплочувствительных соединений используйте более низкую температуру или добавляйте лед в водяную ванну. Заполните конденсирующую камеру сухим льдом и установите скорость вращения до 60-80 об/мин. Добавьте около 700 мл извлеченных метаболитов в 1 л испаряющейся колбы, прикрепите к ротовому столбу и опустите в водяную ванну. Включите водонагреватель и установите до 25 градусов по Цельсию. Начните вращение испаряющейся колбы, включите вакуумную систему и постепенно увеличивайте всасывание, чтобы избежать быстрого кипения раствора метаболита в мусорную колбу. Испаренный растворитель должен начать конденсироваться и капать в колбу для сбора конденсата (отходов). Когда в испаряющейся колбе остается всего несколько мл метаболитного раствора, остановите вращения и выключите вакуумную систему. Поднимите испаряющуюся колбу и разгерметизуйте, закрыв вакуумную линию. Сохраните концентрированный метаболитный раствор, оставшийся в испаряющейся колбе. Утилизировать отходы в мусорной колбе. Продолжить роторное испарение, добавив до 700 мл дополнительного извлеченного раствора метаболита в испаряющуюся колбу. Повторите процесс до тех пор, пока не будет сконцентрирован весь извлеченный метаболитный раствор. Удалить концентрированные метаболиты из испаряющейся колбы путем передачи со стеклянной пипеткой в новую пробирку. Промыть испаряющуюся колбу с 5 мл 50/50 (v/v) этиловый ацетат/гексан или желаемую растворительную смесь два раза, перенося раствор полоскания в пробирку. Хранить концентрированные метаболиты при -20 градусах или -80 градусов по Цельсию (в зависимости от стабильности продукта) до дальнейшего использования. Очистка силиковой колонки Подготовка стеклянной посуды путем промывки 1 л стакан, стеклянная воронка, 50 мл пробирки, и 3,2 л хроматографии колонки (оборудованы стеклянный ладу) один раз с гексаном и один раз с этилацетата. Пометьте пробирки 50 мл, которые будут использоваться для сбора фракций. Добавьте 2 л кремнезема геля (230-400 сетки, класс 60) в колонку хроматографии объемом 3,2 л с емкостью 2 л и рифленым диском, затем загрузите песок, чтобы сформировать слой 5 см в верхней части колонны. Подготовьте колонку для хроматографии, тщательно промывки его с 2 l гексана. Во все времена над песчаным слоем колонны должен быть тонкий слой растворителя (0,5 см), чтобы колонна не высохла и не приобретала воздушные карманы. Стеклянный адаптер входе, подключенный к воздушному шлангу, может быть использован для мягкого увеличения скорости потока через столбец, а не только гравитации. Загрузите концентрированный экстракт метаболита (см. раздел 3.2) на столбец. Промыть бутылку, которая содержала образец 3x с гексаном и добавить в столбец, чтобы убедиться, что все образцы были переданы. Используя следующий градиент, загрузите 100 мл за один раз и соберите 50 мл фракций в маркированных пробирках: 100% гексан 3x, 10% (v/v) этиловый ацетат в гексане 3x, 12,5% (v/v) этиловый ацетат в гексане 3x, 15% (v/v) ethatylylx , 20% (v/v) этиловый ацетат в гексане 3x, 40% (v/v) этиловый ацетат в гексане 3x, 60% (v/v) этиловый ацетат в hexanes 3x, и 100% этиловый ацетат 4x.ПРИМЕЧАНИЕ: Градиент должен быть скорректирован на основе сложных размеров и полярностей и желаемого разделения. Используя стеклянную пипетку, перенесите 1 мл с каждой фракции в помеченный пробиркой GC. Проанализируйте каждый образец с помощью GC-MS, чтобы определить, какие фракции содержат желаемые метаболиты и их уровень чистоты.ПРИМЕЧАНИЕ: Метод GC-MS, подходящий для метаболитов, производимых в этом методе, описан в Mafu et al. 201839. Короче говоря, все анализы были выполнены на GC с детектором XL MS с использованием колонки HP-5MS (см. Таблица материалов),объем образца 1 кВ, и шарп температуры печи от 50 до 300 градусов по Цельсию при 20 c мин-1. После определения того, какие фракции содержат соединение (ы) интерес, объединить все фракции, которые содержат то же соединение. Правильно утилизировать фракции, которые не содержат никаких соединений в контейнер для отходов. Повторите процедуру роторного испарения, если это необходимо, чтобы сконцентрировать очищенные метаболиты. Если необходима дополнительная очистка, используйте (полу)preparative HPLC для повышения чистоты продукта. Протоколы HPLC должны быть адаптированы на основе индивидуальных спецификаций оборудования и соединений, представляющих интерес. Оттачивайте высушенные образцы хроматографии кремнезема в гексане 1 мл (дибертена углеводородов) или ацетонитриле (оксигенированные дитерпеноиды), и процедите через фильтршую шприц, чтобы предотвратить загрязнение мелкими частицами. Для неполярных дитерпеноидов используйте колонку CN (см. Таблица материалов)с рекомендуемой скоростью потока 1 мл/мин и гексаном: градиентом этилового ацетата, с фракциями, собранными каждую 1 минуту. Для полярных дитерпеноидов используйте столбец C18 (см. Таблица материалов)с рекомендуемой скоростью потока 3 мл/мин и ацетонитрилом: градиентом воды, с фракциями, собранными каждые 1 минуты. Высушите все очищенные фракции HPLC под потоком азота и повторно прикрепите в гексане 1 мл перед анализом GC-MS для оценки изобилия и чистоты продукта. 4. Производство метаболитов дитерпеноидов с использованием Н. Бентамиана ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь для производства метаболитов дитерпеноидов в Н. бентамиана был адаптирован из ранее сообщалось исследований35,36,40,41. Ниже протокол специфичен для шприца-инфильтрации листьев N. benthamiana. В равной степени подходят другие методы инфильтрации, такие как проникновение вакуума. Двоичные векторные системы Т-ДНК, такие как pCAMBIA130035Su (pLIFE33) или PEA-HT40,41,42, которые позволяют размножение в кишечной палочке и A. tumefaciens и экспрессии генов в растительных хостах подходит для этого протокола. Посадка Никотина Бентамиана Заполните один 750 мл горшок с заливки почвы и воды горшок. Добавьте 20 фунтов семян табака и аккуратно коснитесь пальцем так, чтобы они были в почве. Не покрывайте почвой.ПРИМЕЧАНИЕ: Семена могут быть получены путем самоопыления для распространения семян. Семена для этого эксперимента были получены из Калифорнийского университета в Дэвисе Департамента биологии растений, и являются общедоступными через USDA зародышевой плазмы репозиторий (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450). Оставьте горшок в камере роста со следующими условиями, полив через день, чтобы убедиться, что почва не высохнет. Выращивайте растения при 26 градусах Цельсия и 60% влажности с 16:8 ч день: ночной цикл для всех шагов в этом протоколе. После 1 недели, заполнить 20 горшков с заливки почвы и воды горшки. Используя щипцы, схватить саженец табака за стебель и аккуратно удалить из источника горшок, поместив один саженец в каждый новый горшок и тщательно burring корни. Не повреждает листья или корни. Поливать растения через день, помещая воду в лоток горшки в (также называемый “дно полива”). Каждый четвертый полив, включают общие удобрения в воде в соответствии с инструкциями упаковки. Замораживание-оттепель трансформации Agrobacterium tumefaciens штамм GV3101 компетентных клеток Оттепель Agrobacterium tumefaciens штамм GV3101 (или другой предпочтительный штамм) компетентных клеток на льду (1 ч). Предварительно холод 0,2 мл микроцентрифуговых труб на льду. Теплые soC-носители при 28 градусах Цельсия. Аккуратно смешивайте клетки с наконечником трубы (не труба вверх и вниз) и aliquot 15 зл и в клетках для каждого преобразования в охлажденные микротрубки 1,5 мл. Добавьте 1-5 кЛ (400 нг) ДНК к каждой трубке компетентных клеток и аккуратно перемешайте, соскребая трубку вдоль трубки стойки.ПРИМЕЧАНИЕ: Нежелательные конструкции не должны иметь различные устойчивости к антибиотикам, потому что каждый из них преобразуется отдельно и будет смешан до проникновения. Поместите микротрубки в жидкий азот на 5 мин. Удалите микротрубки из жидкого азота и поместите трубки на стойку комнатного темпа. Оттепель трубки в течение 5 мин в 37 КК инкубатор. Добавьте 250 qL предварительно разогретого (28 градусов по Цельсию) SOC к каждой микротрубке. Встряхните при 28-30 градусах по Цельсию, 225 об/мин, по 3 ч. Плита 50 зл и т.д. преобразованных клеток на пластинах агара LB, содержащих необходимые антибиотики, описанные в таблице 1 с использованием стерильных стеклянных бусин, как описано в шаге 2.1.8. Инкубировать пластины инвертированные при 28-30 градусах по Цельсию на 48 ч. Рост в течение1-го дня инкубации может быть признаком загрязнения. Преобразованные A. tumifaciens могут быть использованы после 2-дневной инкубации или храниться при 4 градусах Цельсия, запечатанных в парафиновой пленке в течение 2 недель. Агробактерия-опосредованный переходный фермент ко-выражение в Nicotiana benthamiana Чернослив 4-недельный Nicotiana benthamiana растений за 2 дня до инфильтрации путем удаления нижних листьев. Оставьте 4 верхних листа. Поливать растения. Не поливать растения 24 ч до инфильтрации, с тем чтобы обеспечить открытые стоматы и легче инфильтрации. Добавьте 10 мл ЛБ с рабочими концентрациями соответствующих антибиотиков для выбранных конструкций и штамма agrobacterium (описано в таблице 1) в стерильную стеклянную пробирку 50 мл с крышкой из фольги. Прививать с помощью пипетки отзыв мазок одной колонии преобразован agrobacterium и извлечь наконечник в LB средств массовой информации. Каждый трансформироватьa Agrobacterium должен иметь по крайней мере 2 малых культур. Инкубировать на ночь при 28 градусах по Цельсию и 220 об/мин. Измерьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600) ночных культур с помощью спектрофотометра. Разбавить ночные культуры до OD600 из 1.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные значения OD600 могут варьироваться при использовании других штаммов Agrobacterium. Распределите 10 мл разбавленной ночной культуры на конические трубки 50 мл. Урожай бактерий центрифугирования при 3500 об/мин в течение 15 минут в комнате темп. Вылейте и отбросьте супернатант. Повторно приостановить культур в 10 мл инфильтрации буфера, мягко встряхивая трубку и прокатки на трубе стойки. OD600 должен равняться 1 для каждой конструкции. Создайте комбинации, желаемые для инфильтрации, объединив равные объемы каждой преобразованной клеточной линии. OD600 должен равняться 1 для каждого проникновения. Оцените 5 мл инфильтрационного раствора на лист, 2 листа на растение. Прикрепите трубки горизонтально к рокеру и осторожно подогнай по 2 ч при комнатной температуре. Проникают 2 листа на растение N. benthamiana, используя приблизительно 5 мл инфильтрационной смеси на лист. Проникать здоровые листья с безигловым шприцем на нижней стороне листьев при оказании контрдавления с пальцем на верхней стороне листа для обеспечения инфильтрации раствор аплодирует ткани листьев. Отметьте все проникнутые листья черным маркером или другим индикатором. Поместите проникнутые растения в камеру роста в течение 5 дней. Держите растения хорошо поливают.ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационного времени в пять дней оказалось достаточным для достижения уровней дитерпеноидов, достаточных для большинства анализов вниз по течению, сохраняя при этом эффективность времени формирования продукта. Более длительные инкубационные периоды могут быть проверены, где требуется более высокое количество продукции. Метаболитная добыча и очистка от преображенной Никотины Бентамианы Урожай проник листья из растений, вырезая их из растения. Добавьте 100 мл жидкого азота и один лист в ступку, затем измельчите с помощью раствора и пестика или тканевой мельницы до получения мелкого порошка. Добавьте порошкообразную ткань в флакон GC-MS к демаркации 500 л. Добавьте 1,5 мл 50/50 (v/v) этиловый ацетат/гексан или желаемую растворительную смесь к флакону и крышке плотно. Для выражений, которые были протестированы, чтобы обеспечить желаемые продукты, бассейн земли ткани в большую колбу или пробирку, а затем добавить 2x количество растворителя, чем объем ткани и встряхнуть в одночасье. Приступить к шагу 4.4.5 для очищения. Поместите все флаконы в багажнике микротрубки и плотно снизойвниз ленту, чтобы закрепиться. Извлекайте под энергичную тряску на ночь при комнатной температуре. Передача 400 л экстракта и 600 л гексана в свежий флакон GC-MS. Не aliquot любой лист ткани. Анализ образцов с помощью GC-MS с помощью метода, описанного в шаге 3.3.6.1. После анализа через GC-MS для присутствия желаемых метаболитов, экстракты листьев бассейна вместе и проходят через роторное испарение, хроматографию кварцевой колонки и HPLC для получения чистых соединений, как описано в разделах 3.2 и 3.3.

Representative Results

Схематический рабочий процесс для производства дитерпеноидов с использованием кишечной палочкиРисунок 1 иллюстрирует описанный рабочий процесс для производства дитерпеноидов. Протокол, изложенный здесь, был адаптирован из ранее описанной платформы E. coli для дитерпеноидного биосинтеза13,32 для использования культур большого объема и очистки желаемых дитерпеноидных продуктов через кремнезем Хроматографии. Чтобы продемонстрировать использование этого протокола, мы использовали недавно выявленный путь долабралексина из кукурузы, который состоит из двух диТпС, Зман2 (m00001d029648) и «mKSL4» (m00001d032858), многофункциональный P450 (CYP71’18, sm00001d01413444) и цитохром P450 редуктаза (mCPR2, mm00001d026483)(рисунок 2). Короче говоря, E. coli BL21DE3-C41 компетентные клетки были предварительно преобразованы с pCDFDuet:IRS и pACYC-Дуэт: GGPPS / ЗмАН2 плазмиды13,32. PCDFDuet:IRS plasmid содержит ключевые ферменты для производства дитерпеноидов-прекурсоров, в том числе 1-дезоксидно- D-ксилулоза-5-фосфат синтазы(dxs), 1-дезокси -D-xylulose-5-фосфат редуктазы (dxr), и изопентенил дифосфат изомеразы(иди),и было показано, что увеличение дитерпеноидобразования образования в e. coli13. PACYC-Дуэт:GGPPS / плазмид змАН2 содержит кукурузы ent-copalyl дифосфат синтаза ЗмАН2 и синетхазы GGPP от Abies grandis. Ферменты, катализирующих совершенные реакции в биосинтезе долабралексина, затем были преобразованы в плазмиды pET28b: «MKSL4» и pETDUET: «mCPR2/mCYP71»18. Для получения подробной информации о последовательности и плазмидных конструкций см. Mafu et al. 201839. Хроматограмма гК-МС из извлеченных ферментных продуктов показана на рисунке 3A,иллюстрирующем образование трех соединений долабралексина, а именно долабрадина (1,2 х 0,25 мг/л культуры), эпоксидолабрена (0,65 х 0,2 мг/л культуры) и эпоксидолабранола (11,4) Культура 1,1 мг/л, как количественно на основе стандартной кривой с использованием дитерпеноидного склареола. Sclareol был использован в качестве эталона, из-за его сходной структуры и химических свойств по сравнению с dolabralexins. Обычно наблюдаемые незначительные побочные продукты включают хлорамфеникол, индол производные oxindole и индол-5-альдегид, и предшественник geranylgeranyl дифосфат (GGPP) (Рисунок 3). Indole обычно представляет собой первичный побочный продукт, но не отображается здесь, из-за его удержания времени короче, чем набор растворителя задержки 7 мин, чтобы сохранить целостность инструмента GC-MS. Схематический рабочий процесс производства дитерпеноидов с использованием N. benthamianaНа рисунке 4 изображен обзор выражения пути долабралексина в Н. Бентамиане. Для продуктов, описанных здесь, следующие конструкции были преобразованы отдельно в Штамм A. tumefaciens GV3101: pLife33:p19 (выражение белка супрессора гена p19 гена), pLife33: tmCYP71’18, pLife33: ЗмЯН2, pLife33: Полнометражные родные последовательности генов пути дольабролексина кукурузы использовались в двоичном векторе T-DNA pLife3341 с резистентностью канамицина для распространения в e. coli и A. tumefaciens. Совместное выражение вверх по течению терпеноидных генов не является обязательным, так как предшественник геранилгеранил дифосфат агеновидно формируется в N. benthamiana. Тем не менее, несколько исследований успешно использовали такие подходы для увеличения образования дитерпеноидов в N. benthamiana14,36,41. Как показано на рисунке 3, совместное выражение успешно производится долабрадин и 15,16-эпоксидолабрена. В отличие от ферментной коэкспрессии в кишечной палочке,15,16-эпоксидолабаннол не был обнаружен в экстрактах метаболита. Наличие 15,16-эпоксидолабена в экстрактах листьев продемонстрировало активность CYP71-18 в Н. Бентамиане. Как 15,16-эпоксидолапронол было показано, что стабильный после извлечения из микробных культур(рисунок 3), а также после изоляции от корневых тканей кукурузы в предыдущих исследованиях39, кажется правдоподобным, что гидроксилированный продукт гликозилированных эндогенными гликозилтрансферазами и впоследствии секвестрированными в вакуолеле, делая его недоступным для извлечения с органическими растворительными смесями, используемыми здесь для извлечения36,43,44,45 ,46. Аналогичные нежелательные изменения продукта в контексте пути инженерных в N. benthamiana были зарегистрированы в предыдущих исследованиях47. Как показано для совместного выражения в E. coli, переходное выражение в N. benthamiana приводит к извлечению нескольких побочных продуктов, в том числе линейных алканов различной длины цепи, основанной на сравнении с базами данных с базовыми массами. Соединение титры, извлеченные из листового материала было установлено, что в среднем 2,4 й/- 0,5 мг долабратина и 0,9 й/- 0,3 мг 15,16-эпоксидолабен на г сухой ткани листьев. Эти титры не могут быть сопоставлены непосредственно с системой совместного выражения кишечной палочки, учитывая различные экспериментальные настройки. Дитерпеноидная очисткаДитерпеноидная очистка была достигнута с помощью кварцевой колонки хроматографии и последующего полу-подготовки HPLC. Метаболит экстракты из 12 L объединенных культур кишечной палочки были очищены с помощью кремнезема колонки хроматографии, чтобы отделить три координационных соединений долабралексина(рисунок 3A). Силика хроматография идеально подходит для достижения высокой чистоты целевых соединений, так как она позволяет простое разделение дитерпена олефинов и оксигенированных производных, и легко удаляет основные загрязняющие веществ, оксиндол, который сохраняется на матрице кремнезема ( Рисунок 3A). Рисунок 1: Рабочий процесс для производства дитерпеноидов в кишечной палочке и очистки метаболита из жидких бактериальных культур. Dashed коробки изображают дополнительные шаги, где требуется дополнительная очистка. (A) Представитель изображение извлеченных E. coli культуры с помощью сепараторной воронки. (B) Репрезентативное изображение очистки экстракта метаболита с использованием кремнезема хроматографии.   Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Долабралексин биосинтетических путей и генов конструкций, используемых в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Результаты GC-MS. Показаны репрезентативные хроматограммы GC-MS очищенных дитерпеноидных продуктов, полученных с помощью ферментных коэкспрессионных анализов в(A) E. coli и (B) N. benthamiana. Идентификация продукции основана на сопоставлении с подлинными стандартами и эталонными масс-спектрами масс-спектральной библиотеки Национального института стандартов и технологий (NIST). 1, оксиндоле; 2, индол-5-альдегид; 3, Пирроло1,2-а-пиразин-1,4-дион, гексагидро-3-(2-метилпропил)-; 4, 6-O-Acetyl-1-4-бромофэнил-тио-а-д-глюкозид S,S-диоксид; 5, долабрадиен; 6, 15,16-эпоксидолабрена; 7, Пирроло1,2-а-пиразин-1,4-дион, гексагидро-3-(фенилметил)-; 8, 15,16-эпоксидолабранол; 9 и 12, неизвестно; 10, хлорамфеникол; 11, 3,7,11,15-тетраметил-2-гексадекен-1-ол; 13-16, алканы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Дитерпеноидноидное производство в Н. Бентамиане. (A) Рабочий процесс производства дитерпеноидов в N. benthamiana и метаболитной очистки из листового материала. . (B) Представитель изображение N. benthamiana растений, готовых к инфильтрации экспериментов, до обрезки. (C) Репрезентативные изображения растений Н. Бентамианы после обреза. (D) Изображение шприцев-проникших листьев. Темные районы были проникли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Более широкое исследование и применение дитерпеноидных натуральных продуктов требует простых, недорогих протоколов для синтеза и очистки достаточного количества желаемых соединений. Быстрое увеличение числа доступных дитерпеноидно-метаболических ферментов из широкого круга видов в настоящее время обеспечивает обширный инвентарь для ферментативного производства дитерпеноидов с использованием микробных и растительных систем хоста. Кроме того, модульная архитектура многих дитерпеноидных путей позволяет использовать ферменты одного и того же или разных видов в комбинаторных инженерных подходах «подключаться и играть» для создания массива природных и новых природных дитерпеноидов продукты2,14,26,35.

E. coli является предпочтительным микробным хостом для биосинтеза природного продукта из-за его надежности, легкости масштабируемости, ограниченной химической сложности для уменьшения загрязнения побочными продуктами, а также богатства доступных инструментов для сборки и экспрессии ДНК Оптимизации. По нашему опыту, платформа, описанная здесь, хорошо подходит для производства продукции, соотносящейся до нескольких сотен мг дитерпеновых олефинов и спиртов, которая подходит для многих приложений ниже по течению, включая те, которые предлагаются здесь. Хотя это и не соответствует промышленному масштабу, описанная здесь производственная платформа может служить основой для дальнейшей оптимизации пути, хозяина и ферментации, как это было успешно продемонстрировано для связанных дитерпеноидов, таких как таксадиен и склареол33 ,34. Чрезмерное выражение ограничения скорости MVA или MEP пути генов была успешно создана для преодоления факторов, ограничивающих урожайность для дитерпеноидов биосинтеза, таких как недостаточное предложение прекурсоров и прекурсор потока в конкурирующих путей13, 32,33,39. Хотя доказано успешное в нескольких исследованиях, плохое выражение и каталитической активности терпеноидов-метаболических эукариотических P450s и других мембранных ферментов в кишечной палочке является вероятным ограничивающим фактором33,39 ,48,49,50,51,52. Использование кодон-оптимизированных последовательностей и белковых модификаций, таких как удаление эндоплазмического пептида сигнала ретикулума или введение пептида пластидного сигнала, оказалось полезным для увеличения растворимого выражения P45014,38 ,49,50,53. Такие модификации были также использованы для микробного совместного выражения кукурузы CYP71’1839, используемой в качестве примера в данном исследовании. Описанные протоколы основаны на использовании плазмидов, несущих один или два гена на конструкцию, все под одним и тем же индуцируемым промоутером. В тех случаях, когда пожеланы более масштабные комбинации генов, желательно использовать различные доступные многогенные кассеты или системы укладки генов для смягчения снижения эффективности трансформации и роста культуры за счет использования нескольких плазмидов и антибиотиков13 .

С более широким наличием генетики и геномики ресурсов, завод принимающих систем также становятся все более пригодными для производства натуральных продуктов. Преимущества включают в себя способность растений производить необходимые природные прекурсоры питание от фотосинтеза, тем самым позволяя образование продукта без необходимости дополнять молекулы-предшественники54,55. Н. бентамиана уже широко используется для функциональной характеристики in vivo и комбинаторного выражения терпеноидов и других естественных продуктовых путей14,35,36,40 . Заметные преимущества использования N. benthamiana в качестве принимающей системы включают эндогенное производство дитерпеноидных прекурсоров, использование родовых генных последовательностей, упрощенное выражение эукариотических P450s, легкость комбинированной трансформации генов (как отдельные антибиотики не требуются для переходного со-трансформации, а также простого извлечения целевых продуктов из листового материала. Там, где это необходимо, производство дитерпеноидов может быть увеличено за счет совместного выражения ключевых генов MEP пути увеличить предложение прекурсоров36,41. Ограничения для масштабируемого производства дитерпеноидов в N. benthamiana являются более сложными по сравнению с жидкими микробными культурами из-за необходимости создания достаточной биомассы растений, более трудоемкой очистки продукта от химически сложных растительная ткань, и возможная нежелательная метаболизация целевых продуктов через, например, окисление, гликозилирование или дефосфорилирование эндогенными ферментами36,43,44,45 ,46,47. Тем не менее, эта процедура может быть масштабирована до мг количества продукции за счет увеличения числа растений, используемых для агроинфильтрации56.

Описанные здесь протоколы добычи и очистки продукции совместимы с E. coli и N. benthamiana,а также S. cerevisiae и другими системами растительного или микробного хозяина, и обеспечивают экономичный подход, который легко созданв как в биологических, так и в химических лабораториях и не требует дорогостоящего очистного оборудования. Извлечение метаболита с использованием сепараторной воронки хорошо подходит для эффективной добычи и фазового разделения до хроматографической очистки. Размеры воронки могут быть легко скорректированы, чтобы обеспечить большие объемы культуры и сократить экспериментальное время, необходимое для извлечения из крупных культур. Мы обнаружили, что использование градиента гексан/этилового ацетата идеально подходит для извлечения дитерпеноидов различной полярности, как показано здесь для группы долабралексинов, которые включают в себя как углеводородные, так и насыщенные кислородом соединения (Рисунок 3). В зависимости от свойств целевых продуктов, другие растворительные смеси могут быть выгодными. Тем не менее, растворители не должны быть неправильно с водой для обеспечения успешной добычи и фазового разделения с использованием техники сепараторной воронки. Кроме того, при использовании этого подхода для производства летучих органических соединений (ЛОС), таких как моно- и сески-терпеноиды и другие ЛОС, необходимо принимать во внимание потерю продукта путем испарения. Хроматографическое разделение дитерпеноидов различных уровней оксигенации с использованием более крупномасштабной кремнеземной колонки было выгодным в нашем опыте, так как оно обеспечивает улучшенное разделение продукта и сводит к минимуму необходимость итеративной очистки при использовании меньших объемов столбцов. Объемы и матрицы столбцов могут быть скорректированы по мере необходимости для желаемого объема культуры и типа натурального продукта. Чистота целевых продуктов, которые могут быть достигнуты с помощью этого протокола подходит для многих приложений ниже по течению, таких как анализы биоактивности или для использования в анализе активности ферментов. Однако там, где требуется более высокий уровень чистоты, например, структурный анализ через ЯМР, чистота продукта может быть эффективно усилена за счет дополнительной очистки с использованием (полу)-подготовки HPLC.

Этот протокол, описанный здесь, был оптимизирован для производства дитерпеноидных натуральных продуктов, но также может быть легко настроен на соответствующие моно-, сески- и три-терпеноиды, а также другие классы натуральных продуктов, просто генерируя желаемый фермент модули для комбинаторного выражения14,57. Однако изменения процедур извлечения и очистки продукции должны приниматься во внимание для соединений с повышенной волатильностью, таких как моно- и сески-терпеноиды, или более высокая полярность и функциональная модификация, о чем свидетельствует гликозилирование многих тритерпеноидов, фенилпропаноидов и других натуральных классов продукции.

Хотя промышленные платформы для производства натуральных продуктов доступны, описанные здесь протоколы предлагают недорогой, настраиваемый инструмент, который можно легко настроить в большинстве лабораторий. Как показано на производство кукурузы dolabralexins здесь и в других местах39, количество продукции и чистоты, которые могут быть достигнуты с помощью этого подхода, как правило, достаточно для облегчения различных ниже по течению анализа и использования, в том числе, но не ограничивается различными исследованиями биоактивности, анализом взаимодействий между организмами, а также для использования в качестве ферментных субстратов или в качестве исходного материала для подходов к полусинтезу.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы с благодарностью признательны д-ру Рубену Петерсу (Университет штата Айова, США) за предоставление конструкций pIRS и pGGx-mAN2. Финансовая поддержка этой работы по NSF Завод-Биотические Взаимодействия Программа (грант 1758976 до П.З.), DOE Ранняя карьера научно-исследовательской программы (грант DE-SC0019178 до П.З.), DOE Объединенный институт генома Сообщества Научная программа (грант CSP2568 в П.З.), NSF Выпускник научно-исследовательской программы стипендий (к KMM), и UC Дэвис Дин Наставничество премии стипендий (к KMM) с благодарностью признали.

Materials

1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent –
7890B GC Agilent –
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. a. n. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Tags

DiterpenoidNatural ProductMetaboliteEnzymatic ProductionPurificationCustomizable ApproachE. ColiCompetent CellsTransformationColony SelectionSmall CultureTerrific BrothPurification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image