ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

注意:ここに記載されているプロトコルには、有害化学物質、鋭利な物体、電気機器、ホットオブジェクト、および怪我を引き起こす可能性のあるその他の危険物の使用が含まれます。適切な個人用保護具を着用し、安全訓練を含む適切な安全手順に従う必要があります。 1. 材料・ソリューションの準備 30分間リソジェニーブロス培地(LB)を調作し、1L当たり、トリプトン10g、細菌酵母エキス5g、NaCl10gを混合し、脱イオン化(DI)水の1Lに溶解する。 1L共発現培養の場合、30分間、2.8Lエルレンマイヤーフラスコミックス12gのトリプトン、24gの細菌酵母エキス、40 mLの10%(v/v)グリセロールを調製し、860 mLのDIで溶解します。10xリン酸バッファーの1.3Lを調作し、リン酸一体化(KH2PO4)の30.03g、リン酸ジカリウム163.02g(K2 HPO4))を調べ、上記培地に添加する。 カタボライト抑圧(SOC)メディアで超最適なスープを準備します。 2%(w/v)トリプトン、0.5%(w/v)細菌酵母エキス、8.5 mM NaCl、および2.5 mM KClを含む溶液を30分間調作し、オートクレーブします。 20 mMの最終濃度で無菌MgSO4とブドウ糖の両方を追加します。pH 7.0 に調整するには、1 M NaOH を使用します。SOCメディアを-20 °Cに保存します。 1Mの1Lを調出し、ピルビン酸ナトリウムを調出す。オートクレーブは15分間で、4°Cで保存します。 1Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクピラノシド(IPTG)の20mLを無菌DI水中に調製する。-20 °Cで1-2 mLのアリコートを保存します。 浸潤バッファーを調出す:10mM MES(1.952g)および10mM MgCl 2(2.033g)をDI水の1Lに溶解させた。4 °Cで保存します。 30分間LB寒天を準備し、オートクレーブ:DI水の100 mLあたり、トリプトン1g、細菌酵母エキス0.5g、NaClの1g、寒天の1.5gを追加します。LB寒天がボトルを処理するのに十分冷めたら、所望のプラスミドの組み合わせに必要な抗生物質を追加します。ペトリ皿を使って寒天皿を注ぎ、4°Cに保存します。 大腸菌およびN.ベンタミアナの化合物生産に関する仕様については、表1を参照してください。リファピシンを含むプレートをホイルに包み、保管時の劣化を防ぎます。 作業濃度(μg/mL) 抗生物質 在庫 (mg/mL) 溶媒 プラスミド1 プラスミド2 3または4プラスミド カルベニシリン 50 H2O 50 25 20 クロラムフェニ コール 30 江藤 30 20 20 カナマイシン 50 H2O 50 25 20 スペクチノマイシン 30 H2O 30 25 20 ゲンタマイシン 50 H2O 30 リファンピシン 10 メタノール 10 表1:大腸菌またはN.ベンタミアナにおけるプラスミド共発現に対する抗生物質濃度。 2.大腸菌におけるジテルペノイド代謝物の生産 注:大腸菌中のジテルペノイド代謝物を産生するためのプロトコルは、ルーベン・J・ピータース博士(アイオワ州立大学、IA、米国)13のグループによって開発された以前に報告された酵素共発現プラットフォームから適応されています。、32. プラスミドの組み合わせを持つ有能な細胞の形質転換。 氷上で化学的に有能な大腸菌細胞を解凍した(BL21DE3-C41細胞は、このプロトコルで使用された)。 1.5 mLマイクロチューブで25μLの有能な細胞に共発現に使用される各構成物の100 ng/μL溶液の1μLを追加します。渦やピペッティングによって混合しないでください。注:TPSおよびP450酵素の最適な発現および活性を考慮するには、いくつかの配列改変を考慮する必要がある。TPSの場合、N末端プラスティアルトランジットペプチドの除去がしばしば不可欠である。具体的には、プラスティアルモノおよびdi-TPSは、典型的には予測されたトランジットペプチドの除去を必要とする(一般的な予測アルゴリズム37を使用して)、一方、サイトソリックsesqui-TPSは通常、全長遺伝子として使用することができる。P450に関しては、コドン最適化ならびにN末端膜ドメインのリーダー配列MAKKTSSKGKとの除去または置換は、多くの場合38、39で有効であることが証明されている。また、P450酵素を共発現する場合には、十分なP450活性を確保するためにシトクロムP450還元酵素(CPR)を含める必要があります。 マイクロチューブラックを通してチューブをそっと削り、10分ごとに混合物を30分間氷の上にインキュベートします。 構成物の所望の組み合わせに必要な抗生物質を含む37°CでSOC培地およびLB寒天プレートをプレインキュベートする。注:共形される各構成物は、最適なタンパク質発現を確保するために、明確な抗生物質耐性と複製の明確な起源を持つ必要があります。 42°Cでセル混合物を1分間熱衝撃し、その後、氷の上で少なくとも2分間インキュベートする。 200 μL の温かい SOC メディアを追加します。 37 °C と 200 rpm で 1 時間のセル混合物を振ります。 温めたLB寒天プレートに約10本のオートクレーブガラスビーズを加えます。セル混合物の100 μLを追加し、蓋を交換します。蓋をしてプレートを水平に振り、細胞を均等に分配します。ガラスビーズを取り外し、ゴミ容器に入れます。あるいは、他の好ましいめっき方法を用いる。 LB寒天プレートを一晩37°Cでインキュベートし、コーティングされた表面を下にしてインキュベートします。形質転換された大腸菌コロニーを用いることができるプレートは、翌日に使用するか、パラフィンフィルムで密封した4°Cで最大2週間保存することができる。 接種培養の準備 翌日、表1に提供される濃度を用いて形質転換プラスミド組み合わせに必要な抗生物質を用いたLB培地の溶液を調記する。 無菌フードで、プラスチック通気キャップ付きの15 mL滅菌ガラス試験管にLB培地の5 mLを転送します。所望の大きな(1L)培養ごとに1本の小さな培養管を調出す。 ピペット先端を使用してLB寒天プレートから個々の大腸菌コロニーを選択します。選択したコロニーを含む1つのピペット先端を各チューブに排出することにより、大腸菌コロニーでLBの各管を接種する。 通気性プラスチックキャップを備えた各接種培養試験管をキャップします。キャップされた大腸菌小さな培養物を37°Cの振盪インキュベーターに12~24時間置きます。 共発現文化の準備と誘導 翌日、10xリン酸バッファーの100mLを調製TBの900mLに加え、最終的なリン酸緩衝液濃度を1倍にする。表1に従って濃度で必要な抗生物質を追加します。 37°Cで140rpmで振り、暖かくなるまで(約30分)。 接種培養の5 mLで1L培養用の培養物の各フラスコを接種する。接種培養チューブ内の接種培養に使用するピペットチップを保持し、その後の工程で有機溶媒を抽出した際に、抽出されたプラスチック汚染物質がないようにします。 600 nm(OD 600)の光学密度が0.6、約3時間に達するまで、200 rpmで振盪でインキュベートします。分光光度計でOD600を測定するには、無菌TBとリン酸バッファーをブランクとして使用します。 所望のOD600で、インキュベーターの設定を16 °Cに設定します。 P450を共発現する場合は、十分なP450共因子産生に不可欠なリボフラビン酸とアミノレブリン酸を作製する。すべての実験のために、4 g/Lリボフラビンと150 g/Lアミノレブリン酸を作ります。リボフラビンは光に敏感なため、使用するまでホイルで包んだ溶液を保管してください。 インキュベーターが16°C(約30分)に達した後、各培養に1mLの1ML、4g/Lリボフラビンの1mL、150g/Lのアミノレブリン酸を各培養に加えます。ジテルペノイド産生のために、十分な前駆体形成を保証するために、1Mピルビン酸ナトリウムの25 mLを各培養物に添加する必要があります。注:このアッセイで使用されるすべての構造体は、同じIPTG誘導性プロモーターの下にあった。異なるプロモーターは、所望に応じて使用することができる。 16°Cおよび140 rpmで72 h. ジテルペノイドを製造する場合は、誘導後1日ごとに25mLのピルビン酸ナトリウムを加える。すぐに使用培養は、代謝産物の分離漏斗抽出のためにすぐに使用されます。文化を収穫したり保管したりしないでください。 3. 代謝物の分離と精製 代謝産物の分離漏斗抽出注:可塑剤の汚染を防ぐために有機溶剤を使用する場合は、ガラス製品とガラスピペットのみを使用することが重要です。 ヒュームフードで、分離漏斗をリングスタンドに固定します。分離漏斗の下に廃棄物ビーカーを置きます。 50/50(v/v)エチル酢酸エチル/ヘキサンの500 mLを分離漏斗に注ぎます。注:溶媒混合物は、標的代謝産物の溶解性および極性に基づいて調整されるべきである。水分解性溶媒は、適切な相分離を確保するために避ける必要があります。 大腸菌培養の500mLを分離漏斗に加え、ガラスストッパーの上に置きます。 漏斗を振り、培養剤と抽出溶媒を混ぜ、約5~10倍。漏斗を逆さまに保持し、圧力を解放するためにヒュームフードに向いている間、頻繁にスピゴットを開くことによって漏斗を脱ガスします。振盪と脱ガス手順2を繰り返します。 漏斗をリングスタンドに直立させ、溶媒層(上)が水性(培養)層(下)から分離するまで、約1分待ちます。注:相間で大量の気泡が観察された場合、5~10 mL EtOHの少量を添加して位相分離を改善することができます。 ストッパーを取り外します。大腸菌層を廃棄物ビーカーに排出し、漏斗中の溶媒層を保持します。 大腸菌培養の残りの500mLと、第1抽出に用いられる同じ500mL溶媒を用いて手順を繰り返す。 抽出された代謝物を含む溶媒をきれいなフラスコに排出します。大腸菌培養による汚染を避ける。 ロータリー蒸発濃度 ロータリー蒸発(rotovap)装置を準備する:水浴を充填し、温度を25 °Cに設定します。熱に敏感な化合物の場合は、低温設定を使用するか、水浴に氷を追加します。凝縮室をドライアイスで満たし、回転速度を60~80rpmに設定します。 抽出された代謝物の約700 mLを1L蒸発フラスコに加え、ロトバップに取り付け、水浴に下げます。水浴ヒーターをオンにし、25 °Cに設定します。 蒸発フラスコの回転を開始し、真空システムをオンにし、代謝液を廃棄物フラスコに急速に沸騰させないように吸引を徐々に増加させる。蒸発した溶媒は凝縮を開始し、凝縮物収集(廃棄物)フラスコに滴下する必要があります。 代謝液の数mLだけが蒸発フラスコに残っている場合は、回転を停止し、真空システムをオフにします。蒸発フラスコを上げ、真空ラインを閉じて減圧します。蒸発フラスコに残存する濃縮代謝液を保持する。廃棄物フラスコに廃棄物を処分します。 蒸発フラスコに最大700mLの追加抽出代謝液を添加してロータリー蒸発を続けます。抽出された代謝液のすべてが濃縮されるまで、プロセスを繰り返します。 ガラスピペットを新しい試験管に移して、蒸発フラスコから濃縮された代謝物を取り除きます。50/50(v/v)エチル酢酸エチルまたは所望の溶媒混合物を2回5mLで蒸発フラスコをすすり、すすり溶液を試験管に移す。 濃縮代謝物は-20°Cまたは-80°C(製品の安定性に応じて)で、さらに使用するまで保管してください。 シリカカラム精製 1Lビーカー、ガラス漏斗、50mL試験管、3.2Lクロマトグラフィーカラム(ガラスフレットを装備)をヘキサンで1回、酢酸エチルで1回洗い流してガラス製品を準備します。分数を収集するために使用される50 mL試験管にラベルを付けます。 2 L のシリカ ゲル (230-400 メッシュ、グレード 60) を 3.2 L クロマトグラフィー カラムに 2 L のリザーバ容量とフリット ディスクを加え、砂をロードして、柱の上部に 5 cm の層を形成します。 2Lのヘキサンで十分に洗い流してクロマトグラフィー用のカラムを準備します。カラムが乾燥したりエアポケットを取得したりしないように、常にカラムの砂層の上に溶媒液の薄い(約0.5センチメートル)層が必要です。エアホースに接続されたガラス入り入り器は、重力だけではなく、カラムを通る流量を穏やかに高めるために使用することができます。 濃縮された代謝産物抽出物(セクション3.2を参照)をカラムにロードします。サンプル3xを含むボトルをヘキサンで洗い流し、カラムに追加して、すべてのサンプルが転送されていることを確認します。 次の勾配を使用して、一度に100 mLをロードし、ラベル付けされた試験管で50 mL分画を収集する:ヘキサン3xで100%ヘキサン3x、10%(v/v)酢酸エチル酢酸エチル3x、15%(vxan)の酢酸エチル、ヘキサン3xで20%(v/v)酢酸エチル、ヘキサン3xで40%(v/v)酢酸エチル、ヘキサン3xで60%(v/v)酢酸エチル、100%酢酸エチル4x。注: グラデーションは、複合サイズと極性と所望の分離に基づいて調整する必要があります。 ガラスピペットを使用して、各分数からラベル付きGCバイアルに1 mLを転送します。GC-MSを介して各サンプルを分析し、所望の代謝産物とその純度を含む分数を決定します。注:この方法で産生される代謝産物に適したGC-MS法は、Mafu et al. 201839に記載されている。簡単に言えば、HP-5MSカラム(材料の表を参照)、サンプル体積1μL、オーブン温度ランプを20°C分-1で50°Cから300°Cに使用して、XL MS検出器を用いてGC上ですべての解析を行いました。 対象の化合物を含む分数を決定した後、同じ化合物を含むすべての画分を結合します。化合物を含まない分数を廃棄物容器に適切に廃棄します。精製された代謝物を濃縮するために必要に応じて、回転性蒸発手順を繰り返します。 追加の精製が必要な場合は、(半)準備HPLCを使用して製品の純度を向上させる。HPLC プロトコルは、個々の機器の仕様および対象の化合物に基づいて適合する必要があります。 乾燥したシリカクロマトグラフィーサンプルを1mLヘキサン(ジテルペン炭化水素)またはアセトニトリル(酸素化ジテルペノイド)で再中断し、フィルターシリンジを通してフィルターを通して小さな粒子による汚染を防ぎます。 非極性ジテルペノイドの場合は、推奨流量1mL/分のCNカラム(材料の表を参照)とヘキサン:酢酸エチルグラデーションを使用し、分数を1分ごとに収集します。 極性ジターペノイドの場合は、推奨流量3mL/分のC18カラム(材料表参照)とアセトニトリル:水勾配を使用し、分数を1分ごとに収集します。 窒素流れの下ですべてのHPLC精製分画を乾燥させ、GC-MS分析の前に1mLヘキサンで再中断し、製品の豊富さと純度を評価します。 4. N.ベンタミアナを用いてジテルペノイド代謝物の生産 注:N.ベンタミアナでジテルペノイド代謝物を産生するためのここに記載されたプロトコルは、以前に報告された研究35、36、40、41から適応されている。以下のプロトコルは、N.ベンタミアナ葉の注射器浸潤に特異的である。真空浸潤などの他の浸潤方法も同様に適している。pCAMBIA130035Su(pLIFE33)またはpEAQ-HT40、41、42などのバイナリT-DNAベクターシステムは、植物宿生における大腸菌およびA.ツメファシアンおよび遺伝子発現における伝播を可能にする。このプロトコルに適しています。 ニコチアナ・ベンタミアーナの植え付け 750 mLポット1ポットをポッティング土壌で充填し、ポットに水を与えます。20本のタバコの種を加え、指で軽くタップして土の中に入ります。土で覆わな注:種子は、種子伝播のための自己受粉を介して生成することができます。この実験の種子は、UCデイビス植物生物学科から入手され、USDA胚芽貯蔵所(https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450)を通じて一般に入手可能です。 次の条件で成長室にポットを残し、土壌が乾燥しないように1日おきに水やりします。16:8 h日で26 °Cと60%の湿度で植物を成長させる:このプロトコルのすべてのステップのための夜のサイクル。 1週間後、ポットの土で約20ポットを充填し、ポットに水を与えます。鉗子を使用して、茎でタバコの苗をつかみ、ソースポットから穏やかに取り除き、各新しいポットに1本の苗を入れ、慎重に根を埋めます。葉や根を傷つけないようにしてください。 ポットが入っているトレイに水を入れることによって、一日おきに植物に水をかけます(「ボトムウォーターリング」とも呼ばれます)。すべての第四の水やりは、パッケージの指示に従って水中に一般的な肥料を含む。 アグロバクテリウム・ツメファシエン株GV3101有能細胞の凍結融解形 解凍アグロバクテリウム・ツメファシエンス株GV3101(または他の好ましい株)氷上の有能な細胞(〜1時間)。氷上の0.2 mLマイクロ遠心管を冷やす前に。28 °Cで暖かいSOC媒体。 ピペット先端(ピペットの上下に行わない)とアリコート15 μLの細胞を穏やかに混合し、チルド1.5 mLマイクロチューブへの変換ごとにセルを15 μLとします。 有能な細胞の各チューブにDNAの1-5 μL(〜400 ng)を追加し、チューブラックに沿ってチューブを削ることによって穏やかに混合します。注:所望の構造体は、それぞれが別々に変換され、浸潤前に混合されるので、異なる抗生物質耐性を持つ必要はありません。 液体窒素中にマイクロチューブを5分間入れます。 液体窒素からマイクロチューブを取り出し、チューブを部屋の温度ラックに置きます。37°Cインキュベーターで5分間チューブを解凍します。 各マイクロチューブに予温められた(28°C)SOCの250 μLを加える。28~30°C、225rpm、3時間振ります。 ステップ2.1.8に記載されているように、表1に記載の必要な抗生物質を含むLB寒天プレート上の形質転換細胞のプレート50 μL。 インキュベーション1日目以内の成長は、28〜30°Cで48〜30°Cで反転し、汚染の兆候でありうる。形質転換A.ツミファシエンは、2日間のインキュベーションに続いて使用するか、または2週間までパラフィンフィルムで密封された4°Cで保存することができる。 ニコチアナ・ベンタミアナにおけるアグロバクテリウム-媒介過性酵素共発現 プルーン4週齢のニコチアナ・ベンタミアナ植物は、下部葉を除去して浸潤する2日前に植物を植える。一番上の葉を4つ残します。植物に水をやれ浸潤前に植物に24時間水を与え、開いた座腹部と容易な浸潤を可能にする。 選択した構造体およびアグロバクテリウム株(表1に記載)に適切な抗生物質の作業濃度を有するLBの10 mLを、ホイル蓋付きの50mL無菌ガラス試験管に加える。 形質転換されたアグロバクテリウムの単一のコロニーを綿棒にし、LB媒体に先端を排出するためにピペット先端を使用して接種する。各アグロバクテリウム形質転換剤は、少なくとも2つの小さな培養物を有する必要があります。 28 °C および 220 rpm で一晩インキュベートします。 分光光度計を使用して、一晩培養物の600nm(OD600)で光学密度を測定します。一晩培養物を1のOD600に希釈する。注:最適なOD600値は、他のアグロバクテリウム株を使用する場合に異なる場合があります。 希釈された一晩培養物の10mLを50mL円錐管に分配する。 室温で15分間3500rpmで遠心分離によって細菌を収穫する。注ぎ、上清を捨てます。 チューブを静かに振り、チューブラックに転がすことで、10 mL浸潤バッファー内の培養物を再中断します。OD600は、各コンストラクトに対して 1 に等しい必要があります。 各変換されたセルラインの等しい体積を組み合わせることにより、浸潤に必要な組み合わせを生成します。OD600は浸潤ごとに1に等しいはずです。葉1枚につき浸潤溶液の5mL、植物当たり2葉を推定する。 ロッカーにチューブを水平に取り付け、室温で2時間ゆっくりと揺れます。 葉1枚につき約5mLの浸潤混合物を用いてN.ベンタミアナ植物当たり〜2葉を浸潤する。葉の下側に針のない注射器で健康な葉を浸潤し、葉の上面に指で反圧を行い、浸潤液が葉組織を満たしていることを確認します。 すべての浸透した葉に黒いマーカーまたはその他のインジケーターをマークします。5日間成長室に浸潤植物を置きます。植物に十分な水をまき続けてください。注:5日間のインキュベーション時間は、製品形成の時間効率を維持しながら、ほとんどの下流分析に十分なジテルペノイドレベルに達するのに十分であることが証明されています。より高い製品量が必要な場合、より長いインキュベーション期間をテストすることができます。 形質転換されたニコチアナ・ベンタミアナからの代謝産物抽出と精製 収穫は、植物からそれらをクリッピングすることにより、植物から浸透葉。モルタルに液体窒素と単葉を約100mL加え、微粉末が得るまでモルタルと害虫またはティッシュミルを用いて粉砕する。 500 μL 境界に粉末組織を GC-MS バイアルに追加します。50/50(v/v)エチル酢酸エチルまたは所望の溶媒混合物の1.5 mLをバイアルとキャップにしっかりと加えます。 所望の製品を提供するためにテストされた発式の場合、より大きなフラスコまたは試験管に地盤組織をプールし、組織体積よりも約2倍の溶媒量を加え、一晩振る。精製のためにステップ4.4.5に進みます。 すべてのバイアルをマイクロチューブラックに入れ、テープをしっかりと下に置いて固定します。室温で一晩激しく揺れる下で抽出する。 抽出物400μL、ヘキサン600μLを新鮮なGC-MSバイアルに移します。葉組織をアリコートしないでください。手順 3.3.6.1 で説明した方法を使用して、GC-MS を使用してサンプルを分析します。 所望の代謝産物の存在をGC-MSを介して分析した後、プール葉抽出物は一緒に、ロータリー蒸発、シリカカラムクロマトグラフィー、およびHPLCを介して進み、セクション3.2および3.3に記載されている純粋な化合物を得る。