JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
português

Automatically Generated
Biochemistry

Uma abordagem personalizável para a produção enzimática e purificação de produtos naturais de Diterpenóides

Published: October 04, 2019
doi:
10.3791/59992
, , , , ,
1Department of Plant Biology,University of California Davis

Summary

Aqui apresentamos protocolos de fácil utilização para a produção e purificação de metabólitos diterpenóides através da expressão combinatória de enzimas biossintéticas em Escherichia coli ou Nicotiana javanica, seguida de produto cromatográfico Purificação. Os metabólitos resultantes são adequados para vários estudos, incluindo caracterização de estruturas moleculares, estudos funcionais enzimáticos e ensaios de Bioatividade.

Abstract

Os diterpenóides formam uma classe diversa de produtos naturais de pequenas moléculas que são amplamente distribuídos pelos reinos da vida e têm funções biológicas críticas em processos de desenvolvimento, interações interorganismal e adaptação ambiental. Devido a essas várias Bioatividades, muitos diterpenóides também são de importância econômica como produtos farmacêuticos, aditivos alimentares, biocombustíveis e outros Bioprodutos. A genômica avançada e as abordagens bioquímicas permitiram um rápido aumento no conhecimento dos genes, enzimas e vias diterpenóides-metabólicos. No entanto, a complexidade estrutural dos diterpenóides e a estreita distribuição taxonômica de compostos individuais em muitas vezes apenas uma única espécie permanecem fatores constronômicos para sua produção eficiente. A disponibilidade de uma escala mais larga de enzimas metabólicas fornece agora recursos para produzir diterpenóides em títulos e na pureza suficientes para facilitar uma investigação mais profunda deste grupo importante do metabolito. Baseando-se em ferramentas estabelecidas para a coexpressão de enzimas microbianas e vegetais, apresentamos um protocolo facilmente operado e personalizável para a produção enzimática de diterpenóides em Escherichia coli ou Nicotiana javanica, e a purificação de produtos desejados através de cromatografia de sílica e HPLC semipreparativa. Usando o grupo de diterpenóides do dolabralexin do milho (Zea Mays) como um exemplo, nós destacamos como as combinações modulares de enzimas do diterpenos sintase (ditps) e do citocromo P450 monooxigenase (P450) podem ser usadas para gerar andaimes ciclodecanos diferentes. Compostos purificados podem ser usados em várias aplicações a jusante, tais como análises estruturais do metabolito, estudos de função da estrutura enzimática e experimentos de Bioatividade in vitro e em planta.

Introduction

Os diterpenóides compreendem um grupo quimicamente diverso de mais de 12.000 produtos naturais predominantemente policíclicos de 20 carbonos que desempenham papéis críticos em muitos organismos1. Fungos e plantas produzem a maior diversidade de diterpenóides, mas as bactérias também foram mostradas para formar diterpenóides bioativos (ver comentários2,3,4,5). Enraizada na sua vasta diversidade estrutural, os diterpenóides servem uma infinidade de funções biológicas. Alguns diterpenóides, tais como hormônios de crescimento Giberelina, têm funções essenciais em processos de desenvolvimento5. No entanto, a maioria dos diterpenóides servem como mediadores da defesa química e interorganismal interações. Entre estes, os ácidos da resina do diterpenos na defesa da praga e do micróbio patogénico de árvores coníferas e de misturas espécie-específicas de diterpenóides antimicrobianos em colheitas de alimento principais tais como o milho (Zea Mays) e o arroz (Oryza sativa) foram o mais extensivamente estudou6,7. Estas Bioatividades fornecem um repositório químico rico para aplicaçõescomerciais, eos diterpenóides seleto são usados como produtos farmacêuticos importantes, aditivos de alimento, adesivos, e outros Bioprodutos da vida moderna diária8,9 ,10. Para avançar a pesquisa sobre a diversidade natural e as funções biológicas dos diterpenóides e, finalmente, promover aplicações comerciais mais amplas, são necessárias ferramentas para a preparação rentável de compostos puros. O isolamento em grande escala do material vegetal foi estabelecido para alguns Bioprodutos diterpenóides, como os ácidos de resina diterpeno que são produzidos como um subproduto da indústria de celulose e papel8. No entanto, a acumulação de diterpenóides em apenas tecidos específicos e regulação apertada por estímulos ambientais, muitas vezes limita o isolamento de quantidades suficientes de produtos do produtor natural2. Além disso, a complexidade estrutural dos diterpenóides dificulta sua produção através da síntese química, embora tais abordagens tenham sido bem-sucedidas em vários casos11,12. Com a disponibilidade de tecnologias avançadas de genômica e bioquímica, as plataformas de produção enzimática ganharam atenção crescente para a produção de uma variedade de compostos diterpenóides (ver comentários13,14, 15,16,17,18).

Todos os terpenóides, incluindo diterpenóides, são derivados de dois precursores isoméricos isoprenóides, isopentenila difosfato (IPP) e dimetilalilo difosfato (DMAPP)19 que, por sua vez, são formados através do mevalonato (MVA) ou o metilerythritol-5-fosfato (MEP) caminho. A biossíntese de terpenóides prossegue através da via MEP em bactérias e a via MVA em fungos, enquanto as plantas possuem um MVA citosólico e uma via de Pemáx núcleo, sendo esta última a principal via para a formação de diterpenóides20. A condensação de IPP e DMAPP por prenilo transferases produz o precursor central de 20 carbonos para todos os diterpenóides, difosfato de difosfato (GGPP)20. A jusante da formação GGPP, duas famílias enzimáticas, terpenos sintases (tpss) e citocromo P450 monooxigenases (P450s) controlam em grande parte a formação da vasta diversidade química do metabolismo terpenóide21,22. Os sintases do diterpenos (ditpss) catalisam a ciclização e o rearranjo carbocation-conduzidos cometidos de GGPP para dar forma a vários andaimes estereosespecíficos do diterpenos do BI-, poli-, ou macro-cíclicos1,3,23, a 24. A oxigenação e a decoração funcional mais adicional destes andaimes são facilitadas então por enzimas P450 e selecionam outras famílias da enzima22,25. Os TPSs e P450s comumente existem como famílias multigênicas específicas de espécies que podem formar redes biossintéticas modulares, onde a combinação de diferentes módulos enzimáticos ao longo de um esquema comum possibilita a formação de uma ampla gama de compostos2, a descoberta 26. The rápida de enzimas funcionalmente distintas que operam-se em caminhos terpenoid modulares nos últimos anos forneceu oportunidades de expansão para seu uso como uma lista de peças versátil para a engenharia metabólica de vias parciais ou completas em plataformas de produção microbiana e de base vegetal. Por exemplo, levedura (Saccharomyces cerevisiae) tem sido aplicada com sucesso para o engenheiro de vias multienzimáticas para a fabricação de bioprodutos terpenóides, como a droga antimalárico artemisinina27, os biocombustíveis sesquiterpenóides bisaboleno e farneseno28, mas também selecionar diterpenóides29,30,31. Da mesma forma, plataformas de Escherichia coli projetadas para a manufatura em escala industrial foram estabelecidas para alguns metabólitos diterpenóides, incluindo o taxadieno precursora Taxol usado como um medicamento anticancerígeno e o álcool diterpeno, sclareol , usado na indústria da fragrância13,32,33,34. Os avanços nas tecnologias de engenharia genética e transformação também tornaram os sistemas hospedeiros de plantas cada vez mais viáveis para a produção de produtos naturais de plantas9,14,35,36. Em particular, o parente próximo do tabaco, Nicotiana javanica, transformou-se um chassi amplamente utilizado para a análise e a engenharia do caminho terpenoid, devido à facilidade da transformação Agrobacterium-negociada de combinações múltiplas do gene , biossíntese eficiente de precursores endógenos e alta biomassa14,35,36.

Baseando-se nestas plataformas estabelecidas para a biossíntese terpenóide, descrevemos aqui métodos fáceis de usar e rentáveis para a produção enzimática de diterpenóides e a purificação de compostos individuais. Os protocolos apresentados ilustram como as plataformas de e. coli e de N. javanica projetaram para a biossíntese realçada do precursor do ciclodecanos podem ser utilizadas para a expressão combinatória de diferentes enzimas de ditpss e de P450 para gerar compostos diterpenóides desejados. A aplicação deste protocolo para produzir e purificar os diterpenóides estruturalmente diferentes é mostrada pelo exemplo de diterpenóides especializados do milho (Zea Mays), denominado dolabralexins, a biossíntese endógena de que recruta dois ditps e um P450 Enzima. A purificação de dolabralexins diferentes que variam das olefinas aos derivados oxigenados é conseguida então combinando a extração funil do funil com a cromatografia em grande escala da coluna do silicone e a cromatografia líquida de alta pressão preparativa (HPLC). Os protocolos descritos são otimizados para a produção de diterpenóides, mas também podem ser prontamente adaptados para classes terpenóides relacionadas, bem como outros produtos naturais para os quais os recursos enzimáticos estão disponíveis. Os compostos produzidos com esta abordagem são adequados para várias aplicações a jusante, incluindo, mas não se limitando a, a caracterização estrutural através da análise de ressonância magnética nuclear (RMN), utilização como substratos para estudos funcionais enzimáticos, e uma gama de ensaios de Bioatividade.

Protocol

Cuidado: os protocolos descritos aqui incluem o uso de produtos químicos perigosos, objetos afiados, dispositivos elétricos, objetos quentes, e outros perigos que podem resultar em ferimento. Devem ser usados equipamentos de proteção individual adequados, devendo ser seguidos os procedimentos de segurança adequados, incluindo os treinamentos de segurança. 1. preparação de materiais e soluções Prepare e esterilize o meio de caldo de lisogenia (LB) por 30 min: por 1 L de meio, misture 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura bacteriana e 10 g de NaCl e dissolva em 1 L de água desionizada (DI). Para 1 L de culturas de coexpressão, prepare e autoclave ótimo caldo (TB) médio para 30 min: em uma 2,8 L Erlenmeyer mistura de balão 12 g de triptona, 24 g de extrato de levedura bacteriana, e 40 mL de 10% (v/v) glicerol e dissolver em 860 mL de água DI. Preparar e autoclave 1,3 L de tampão fosfato 10x [1,3 L de água DI, 30, 3 g de Fosfato monopotássico (KH2po4) e 163, 2 g de fosfato dipotássico (K2HPO4)] e acrescentar ao meio acima. Prepare o caldo super optimal com a mídia de repressão Catabolite (SOC). Prepare e autoclave para 30 min uma solução contendo 2% (w/v) tryptone, 0,5% (w/v) extrato de levedura bacteriana, 8,5 mM NaCl, e 2,5 mM KCl. Adicione a MgSO4 e a glicose estéreis com uma concentração final de 20 milímetros. Use o NaOH de 1 M para ajustar ao pH 7,0. Armazene a mídia SOC a-20 ° c. Prepare 1 L de piruvato de sódio a 1 M. Autoclave por 15 min e armazenar a 4 ° c. Prepare 20 mL de 1 M de isopropílico β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) em água DI estéril. Conservar alíquotas de 1 – 2 mL a-20 ° c. Prepare tampão de infiltração: 10 mM MES (1,952 g) e 10 mM MgCl2 (2, 33 g) dissolvidos em 1 L de água di. Conservar a 4 ° c. Prepare e esterilize Agar LB por 30 min: por 100 mL de água de DI, adicione 1 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura bacteriana, 1 g de NaCl e 1,5 g de agar. Uma vez que o agar LB é fresco o suficiente para manusear a garrafa, adicione antibióticos conforme necessário para as combinações de plasmídeo desejadas. Despeje as placas de agar usando pratos de Petri e armazene a 4 ° c. Ver tabela 1 para as especificações relativas à produção de compostos em e. coli e N. javanica, respetivamente. Envolva as placas contendo rifampicina em folha para evitar a degradação no armazenamento. Concentração de trabalho (μg/mL) Antibiótico Estoque (mg/mL) Solvente 1 plasmídeo 2 plasmís 3 ou 4 plasmís Carbenicilina 50 H2O 50 25 20 Cloranfenicol 30 Etoh 30 20 20 Canamicina 50 H2O 50 25 20 Espectinomicina 30 H2O 30 25 20 Gentamycin 50 H2O 30 Rifampicin 10 MeOH 10 Tabela 1: concentrações de antibióticos para a coexpressão de plasmídeo em E. coli ou N. javanica. 2. produção de metabolitos diterpenóides em E. coli Nota: o protocolo descrito aqui para a produção de metabólitos diterpenóides em E. coli foi adaptado de uma plataforma de coexpressão enzimática previamente relatada desenvolvida pelo grupo do Dr. Reuben J. Peters (Iowa State University, ia, EUA)13 ,32. Transformação de células competentes com combinações de plasmídeo. Thaw quimicamente competentes células de E. coli no gelo (BL21DE3-C41 células foram utilizadas neste protocolo). Adicionar 1 μL de uma solução de 100 ng/μL de cada construto utilizado para coexpressão a 25 μL de células competentes num microtubo de 1,5 mL. Não vórtice nem misture com pipetagem.Nota: para a expressão e a atividade ideais de enzimas TPS e P450, várias modificações de sequência precisam ser consideradas. Para TPS, a remoção do peptídeo de trânsito de núcleo N-terminal é muitas vezes essencial. Especificamente, os mono-e di-TPS do núcleo exigem tipicamente a remoção do peptide previsto do trânsito (usando algoritmos comuns da predição37), visto que sesqui-TPS citosólico pode geralmente ser usado como genes full-length. Com considerações a P450s, a optimização do Codon assim como a remoção ou a recolocação com a seqüência do líder makktsskgk do domínio do transmembrana do N-terminal provou eficaz em muitos casos38,39. Além, quando coexpressando enzimas P450 um citocromo P450 redutase (CPR) deve ser incluído para assegurar a suficiente atividade P450. Incubar a mistura no gelo durante 30 min. Misture a cada 10 minutos, raspando suavemente o tubo através de um rack de microtubos. Pré-incubar meios SOC e placas de agar LB a 37 ° c contendo antibióticos conforme necessário para a combinação desejada de construções.Nota: cada construto a ser cotransformado deve ter uma resistência antibiótica distinta, bem como origens distintas de replicação para garantir a expressão de proteína ideal. Choque térmico a mistura de células a 42 ° c durante 1 minuto e, em seguida, incubar no gelo durante pelo menos 2 min. Adicionar 200 μL de suportes de dados SOC quentes. Agitar a mistura de células durante 1 h a 37 ° c e 200 rpm. Adicione cerca de 10 esferas de vidro autoclavadas à placa de agar LB aquecida. Adicionar 100 μL da mistura de células e substituir a tampa. Agitar a placa horizontalmente com a tampa para distribuir as células uniformemente. Retire os grânulos de vidro tocando-os em um recipiente de resíduos. Alternativamente, use outros métodos de chapeamento preferidos. Incubar a placa de agar LB a 37 ° c durante a noite com a superfície revestida virada para baixo. A placa com colônias transformadas de E. coli pode ser usada no dia seguinte ou armazenada a 4 ° c selada em película de parafina por até 2 semanas. Preparação de culturas de inoculação No dia seguinte, prepare uma solução de meio LB com antibióticos necessários para a combinação de plasmídeo transformada utilizando as concentrações fornecidas na tabela 1. Num capuz estéril, transfira 5 mL de meio LB para um tubo de ensaio de vidro estéril de 15 mL com uma tampa plástica respirável. Prepare um pequeno tubo de cultura para cada grande (1 L) cultura desejada. Selecione colônias individuais de E. coli da placa de agar lb usando uma ponta de pipeta. Inocular cada tubo de LB com uma colônia de E. coli , ejectando uma ponta de pipeta contendo uma colônia selecionada em cada tubo. Tampe cada tubo de teste de cultura de inoculação com um tampão plástico respirável. Coloc as culturas pequenas tampadas de E. coli em uma incubadora de agitação de 37 ° c por 12 – 24 h. Preparação e indução de culturas de coexpressão No dia seguinte, adicione 100 mL de tampão de fosfato 10x preparado a 900 mL de TB preparada para uma concentração final de tampão fosfato de 1x. Adicionar antibióticos necessários com concentrações de acordo com a tabela 1. Agitar a 140 RPM a 37 ° c até aquecer (aproximadamente 30 min). Inocular cada frasco de meios para culturas de 1 L com 5 mL da cultura de inoculação. Manter a ponta da pipeta usada para inoculação da cultura de inoculação no tubo de cultura de inoculação, de modo que, após extração com solvente orgânico em etapas subsequentes, não existam contaminantes plásticos extraídos. Incubar com agitação em 200 rpm até que a densidade ótica em 600 nanômetro (OD600) alcangue 0,6, aproximadamente 3 h. Para medir o OD600 com um espectrofotômetro, use uma mistura de TB estéril com tampão fosfato como um espaço em branco. No OD desejado600, ajuste as configurações da incubadora a 16 ° c. Quando coexpressando P450s, prepare recentemente a riboflavina e o ácido aminolevulínico, que são essenciais para a produção de co-factor P450 suficiente. Para cada experimento, faça 4 g/L de riboflavina e 150 g/L de ácido aminolevulínico. Mantenha a solução envolvida na folha até o uso, porque o riboflavina é sensível à luz. Após a incubadora ter atingido 16 ° c (aproximadamente 30 min), adicione 1 mL de 1 M de IPTG, 1 mL de riboflavina 4 g/L e 1 mL de ácido aminolevulínico de 150 g/L a cada cultura. Para a produção de diterpenóides, 25 mL de piruvato de sódio a 1 M devem ser adicionados a cada cultura para assegurar formação precursora suficiente.Nota: todas as construções usadas neste ensaio estavam o mesmo promotor IPTG-inducible. Diferentes promotores podem ser usados como desejado. Incubar a 16 ° c e 140 rpm por 72 h. Adicionar 25 mL de piruvato de sódio cada dia subsequente após a indução, se a produção de diterpenóides. Imediatamente o uso de culturas são imediatamente utilizados para a extração de funil separatório de metabólitos; não colhem ou armazenam culturas. 3. separação e purificação de metabolitos Extração de funil separatório de metabólitosNota: é importante usar somente os produtos vidreiros e as pipetas de vidro ao usar solventes orgânicos para impedir contaminações do plastificador. Em uma capa de fumaça, prenda o funil separatório em um suporte de anel. Coloque uma taça de resíduos debaixo do funil separatório. Despeje 500 mL de 50/50 (v/v) acetato de etila/hexanes no funil separatório.Nota: a mistura de solvente deve ser ajustada com base na solubilidade e na polaridade dos metabolitos visados. Os solventes Water-Miscible devem ser evitados para assegurar a separação apropriada da fase. Adicione 500 mL da cultura de e. coli ao funil separatório e coloque na rolha de vidro. Agitar o funil para misturar a cultura com o solvente de extração, aproximadamente 5 – 10x. Freqüentemente de-gás o funil abrindo o spigot enquanto o funil é mantido de cabeça para baixo e apontou para a capa de fumaça para liberar a pressão. Repita o procedimento de agitação e de gás 2x. Coloque o funil ereto no suporte do anel e aguarde até que a camada de solvente (parte superior) tenha se separado da camada aquosa (cultura) (inferior), aproximadamente 1 min.Nota: quando uma grande quantidade de bolhas é observada na interfase, a adição de um pequeno volume de 5 – 10 mL de EtOH pode ser adicionada para melhorar a separação de fase. Retire a rolha. Drenar a camada de E. coli em uma taça de resíduos, mantendo a camada de solvente no funil. Repita o procedimento utilizando os restantes 500 mL de cultura e . coli e o mesmo solvente de 500 ml utilizado para a primeira extracção. Drenar o solvente que contém os metabolitos extraídos para um frasco limpo. Evite a contaminação com cultura de E. coli . Concentração de evaporação rotativa Prepare o equipamento de evaporação rotativa (rotovap): Encha o banho de água e ajuste a temperatura para 25 ° c. Para compostos sensíveis ao calor, use um ajuste de temperatura mais baixo ou adicione gelo ao banho de água. Encha a câmara de condensação com gelo seco e ajuste a velocidade de giro a 60 – 80 rpm. Adicione aproximadamente 700 mL de metabolitos extraídos a um balão de evaporação de 1 L, prenda-o ao rotovap, e abaixe-o no banho de água. Gire o calefator do banho de água sobre e ajuste a 25 ° c. Comece a rotação do balão evaporando, gire sobre o sistema do vácuo, e aumente gradualmente a sucção para evitar a ebulição rápida da solução do metabolito no frasco waste. O solvente evaporado deve começar a condensação e a pingar no balão de recolha de condensado (resíduos). Quando apenas alguns mL da solução do metabolito permanecem no balão de evaporação, pare as rotações e desligue o sistema de vácuo. Levante o balão evaporando e despressurize fechando a linha do vácuo. Manter a solução de metabolito concentrado remanescente no balão evaporativo. Elimine os resíduos no frasco de resíduos. Continue a evaporação rotativa adicionando até 700 mL de solução adicional de metabolito extraído ao balão evaporativo. Repita o processo até que toda a solução extraída do metabolito esteja concentrada. Retire os metabolitos concentrados do balão de evaporação Transferindo com uma pipeta de vidro para um novo tubo de ensaio. Enxaguar o balão de evaporação com 5 mL de 50/50 (v/v) acetato de etila/hexanes ou mistura solvente desejada duas vezes, transferindo a solução de enxaguamento para o tubo de ensaio. Conservar os metabolitos concentrados a-20 ° c ou-80 ° c (dependendo da estabilidade do produto) até à utilização posterior. Purificação da coluna de sílica Prepare copos enxaguando um copo de 1 L, um funil de vidro, uns tubos de teste de 50 ml, e uma coluna da cromatografia de 3,2 L (equipada com um traste de vidro) uma vez com hexano e uma vez com acetato de etila. Rotule os tubos de ensaio de 50 mL, que serão usados para coletar frações. Adicione 2 L de sílica gel (230 – 400 mesh, grau 60) a uma coluna de cromatografia de 3,2 L com uma capacidade de reservatório de 2 L e um disco com fenda, depois carregue areia para formar uma camada de 5 cm na parte superior da coluna. Prepare a coluna para cromatografia, liberando-a cuidadosamente com 2 L de hexano. Em todos os momentos, deve haver uma fina (~ 0,5 cm) camada do líquido solvente acima da camada de areia da coluna para garantir que a coluna não secar ou adquirir bolsos de ar. Um adaptador de entrada de vidro conectado a uma mangueira de ar pode ser usado para aumentar suavemente a taxa de fluxo através da coluna, em vez de gravidade sozinho. Carregue o extrato do metabolito concentrado (ver secção 3,2) na coluna. Enxague a garrafa que continha a amostra 3x com hexano e adicione à coluna para garantir que toda a amostra tenha sido transferida. Usando o seguinte gradiente, carregar 100 ml de cada vez e coletar 50 ml frações em tubos de ensaio rotulados: 100% hexanos 3x, 10% (v/v) acetato de etilo em hexanos 3x, 12,5% (v/v) acetato de etilo em hexanos 3x, 15% (v/v) acetato de etilo em hexanos 3x , 20% (v/v) acetato de etila em hexanos 3x, 40% (v/v) acetato de etila em hexanos 3x, 60% (v/v) acetato de etilo em hexanos 3x e 100% acetato de etilo 4x.Nota: gradiente deve ser ajustado com base no tamanho composto e polaridades e separação desejada. Utilizando uma pipeta de vidro, transfira 1 mL de cada fração para um frasco de GC rotulado. Analise cada amostra via GC-MS para determinar quais frações contêm os metabólitos desejados e seu nível de pureza.Nota: o método GC-MS adequado para os metabolitos produzidos neste método foi descrito em mafu et al. 201839. Em suma, todas as análises foram realizadas em um GC com um detector XL MS usando uma coluna HP-5MS (ver tabela de materiais), um volume amostral de 1 μl e rampa de temperatura do forno de 50 ° c a 300 ° c a 20 ° c Min-1. Depois de determinar quais frações contêm o composto (s) de juros, combine todas as frações que contenham o mesmo composto. Descarte adequadamente as frações que não contenham nenhum composto em um recipiente de resíduos. Repita o procedimento de evaporação rotativa, se necessário, para concentrar os metabolitos purificados. Se a purificação adicional for necessária, use (semi-) a HPLC preparative para melhorar a pureza do produto. Os protocolos de HPLC devem ser adaptados com base em especificações de equipamentos individuais e compostos de interesse. Ressuscitou amostras de cromatografia de sílica seca em 1 mL de hexano (hidrocarbonetos de diterpeno) ou acetonitrila (diterpenóides oxigenados) e filtre através de uma seringa filtrante para evitar a contaminação com pequenas partículas. Para diterpenóides não polares, use uma coluna CN (ver tabela de materiais) com uma taxa de fluxo recomendada de 1 ml/min e um hexano: gradiente de acetato de etila, com frações coletadas a cada 1 minuto. Para diterpenóides polares, use uma coluna C18 (ver tabela de materiais) com uma taxa de fluxo recomendada de 3 ml/min e um acetonitrila: gradiente de água, com frações coletadas a cada 1 minuto. Seque todas as frações purificadas de HPLC um fluxo de nitrogênio e ressuscitem em 1 mL de hexano antes da análise de GC-MS para avaliar a abundância e a pureza do produto. 4. produção de metabolitos diterpenóides utilizando N. javanica Nota: o protocolo descrito aqui para a produção de metabólitos diterpenóides em N. javanica foi adaptado de estudos previamente relatados35,36,40,41. O protocolo abaixo é específico para a infiltração da seringa de folhas de N. javanica . Outros métodos da infiltração, tais como a infiltração do vácuo são ingualmente apropriados. Os sistemas binários do vetor do T-ADN, tais como pCAMBIA130035Su (pLIFE33) ou peaq-HT40,41,42, que permitem A propagação em e . coli e A. tumefaciens e expressão de gene em anfitriões da planta são adequado para este protocolo. Plantio de Nicotiana javanica Encha o potenciômetro de 1 750 mL com o solo do potting e molhe o potenciômetro. Adicione ~ 20 semente do tabaco e bata delicadamente com o dedo de modo que estejam no solo. Não cubra com o solo.Nota: as sementes podem ser geradas através de Autopolinização para propagação de sementes. As sementes para este experimento foram obtidas do departamento de biologia vegetal da UC Davis, e estão disponíveis publicamente através do repositório de germoplasma do USDA (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450). Deixe o potenciômetro em uma câmara do crescimento com as seguintes circunstâncias, molhando cada outro dia para assegurar-se de que o solo não seque. Cresça plantas em 26 ° c e 60% de umidade com 16:8 h dia: ciclo noturno para todas as etapas neste protocolo. Após 1 semana, encha ~ 20 potenciômetros com solo do potting e molhe os potenciômetros. Usando fórceps, agarre um seedling do tabaco pela haste e retire delicadamente do potenciômetro da fonte, coloc um seedling em cada potenciômetro novo e burring com cuidado as raizes. Não danifique as folhas ou raízes. Molhe as plantas cada outro dia coloc a água na bandeja que os potenciômetros estão dentro (igualmente chamado “molhar inferior”). Cada quarto molhando, inclua o fertilizante genérico na água de acordo com instruções do pacote. Transformação Freeze-Thaw da estirpe de Agrobacterium tumefaciens GV3101 células competentes Thaw Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 (ou outra estirpe preferida) células competentes no gelo (~ 1 h). Pré-Chill 0,2 mL tubos de microcentrífuga no gelo. Mídia quente SOC a 28 ° c. Misture suavemente as células com a ponta do Pipet (não Pipet para cima e para baixo) e alíquota 15 μL de células para cada transformação nos microtubos refrigerados 1,5 ml. Adicione 1-5 μL (~ 400 NG) de DNA a cada tubo de células competentes e misture suavemente raspando o tubo ao longo de um rack de tubo.Nota: construções desejadas não precisam ter diferentes resistências antibióticas porque cada uma delas está sendo transformada separadamente e será misturada antes da infiltração. Coloque microtubos em nitrogênio líquido por 5 min. Remova os microtubos do nitrogênio líquido e coloc os tubos na cremalheira do quarto-Temp. Tubos de descongelamento por 5 min em incubadora de 37 ° c. Adicionar 250 μL do SOC pré-aquecido (28 ° c) a cada microtubo. Agitar a 28 – 30 ° c, 225 rpm, durante 3 h. Placa 50 μL de células transformadas em placas de agar LB contendo os antibióticos necessários descritos na tabela 1 utilizando grânulos de vidro estéreis, conforme descrito na etapa 2.1.8. Incubar as placas invertidas a 28 – 30 ° c para 48 h. o crescimento dentro do dia 1St da incubação pode ser um sinal da contaminação. A . tumifaciens transformada pode ser usada após a incubação de 2 dias ou armazenada a 4 ° c selada em película de parafina por até 2 semanas. Coexpressão da enzima transitória mediada por Agrobacteriumem Nicotiana javanica Prune 4-week-old Nicotiana javanica plantas 2 dias antes da infiltração, removendo as folhas inferiores. Deixe 4 folhas superiores. Molhe as plantas. Não molhe as plantas 24 h antes da infiltração a fim permitir o estômatos aberto e a infiltração mais fácil. Adicionar 10 mL de LB com concentrações de trabalho dos antibióticos apropriados para construções escolhidas e estirpe de Agrobacterium (descrita na tabela 1) a um tubo de ensaio de vidro estéril de 50 ml com uma tampa da folha. Inoculate usando uma ponta da pipeta para cotonete uma única colônia de Agrobacterium transformado e ejetar a ponta na mídia lb. Cada transformante de Agrobacterium deve ter pelo menos 2 culturas pequenas. Incubar durante a noite a 28 ° c e 220 rpm. Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) das culturas durante a noite usando um espectrofotômetro. Diluir as culturas overnight para um OD600 de 1.Nota: os valores óptimos600 do OD podem variar ao usar outras estirpes do Agrobacterium . Distribuir 10 mL de cultura diluída durante a noite em 50 mL de tubos cônicos. Colher as bactérias por centrifugação a 3500 rpm por 15 min em temperatura ambiente. Despeje e descarte o sobrenadante. Re-suspender as culturas em 10 mL tampão de infiltração, agitando suavemente o tubo e rolando em um rack de tubo. O OD600 deve ser igual a 1 para cada construção. Gere as combinações desejadas para infiltrações combinando volumes iguais de cada linha celular transformada. O OD600 deve ser igual a 1 para cada infiltração. Estimativa de 5 mL de solução de infiltração por folha, 2 folhas por planta. Prenda os tubos horizontalmente a um balancim e balanç delicadamente para 2 h na temperatura ambiente. Infiltrar ~ 2 folhas por planta de N. javanica usando aproximadamente 5 ml de mistura de infiltração por folha. Infiltrar folhas saudáveis com uma seringa Needleless na parte inferior das folhas, exercendo uma contrapressão com um dedo no lado superior da folha para garantir a solução de infiltração inunda o tecido foliar. Marque todas as folhas infiltradas com um marcador preto ou outro indicador. Coloque as plantas infiltradas na câmara de crescimento por 5 dias. Mantenha as plantas bem regadas.Nota: um tempo de incubação de cinco dias provou ser suficiente para atingir os níveis de diterpenóides suficientes para a maioria das análises a jusante, mantendo a eficiência de tempo da formação do produto. Períodos de incubação mais longos podem ser testados, onde maiores quantidades de produto são necessárias. Extração e purificação do metabolito de Nicotiana javanica transformada Colha as folhas infiltradas das plantas cortando as da planta. Adicionar ~ 100 mL de nitrogênio líquido e uma única folha para um almofariz, em seguida, moer usando um almofariz e pilão ou moinho de tecido até obter um pó fino. Adicione o tecido pulverizado a um frasco de GC-MS à demarcação de 500 μL. Adicionar 1,5 mL de 50/50 (v/v) acetato de etila/hexano ou mistura de solvente desejada ao frasco e tampa firmemente. Para expressões que foram testadas para fornecer os produtos desejados, tecido da terra da piscina em um balão maior ou tubo de ensaio, em seguida, adicione ~ 2x a quantidade de solvente do que o volume do tecido e agitar durante a noite. Prossiga para o passo 4.4.5 para a purificação. Coloque todos os frascos em um rack de microtubos e tape para baixo firmemente para garantir. Extrato vigoroso agitação durante a noite na temperatura ambiente. Transferir 400 μL de extracto e 600 μL de hexano para um frasco de GC-MS fresco. Não alíquota nenhum tecido foliar. Analise amostras usando GC-MS usando o método descrito na etapa 3.3.6.1. Após análise via GC-MS para presença de metabólitos desejados, extratos de folhas de piscina juntas e procedem por evaporação rotativa, cromatografia em coluna de sílica e HPLC para obtenção de compostos puros conforme descrito nas seções 3,2 e 3,3.

Representative Results

Fluxo de trabalho esquemático para produção de diterpenóides usando E. coliA Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho descrito para produção de diterpenóides. O protocolo esboçado aqui foi adaptado de uma plataforma previamente descrita de E. coli para a biossíntese do ciclodecanos13,32 para o uso de culturas do maior-volume e a purificação de produtos desejados do ciclodecanos através da sílica Cromatografia. Para demonstrar o uso deste protocolo, utilizou-se uma via de dolabralexina recém-identificada do milho que compreende dois diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) e ZmKSL4 (Zm00001d032858), um P450 multi-funcional (CYP71Z18, Zm00001d014134) e um citocromo P450 redutase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Figura 2). Em suma, as células competentes de e. coli BL21DE3-C41 foram pré-transformadas com o pcdfduet: IRS e pacyc-Duet: ggpps/ZmAN2 plasmídeos13,32. O pcdfduet: o plasmídeo do IRS contem enzimas chaves para a produção do precursor do ciclodecanos, incluindo 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate sintase (DXS), 1-deoxy-d-xylulose-5-fosfato redutase (DXR), e isopentenila difosfato isomerase (IDI), e foi mostrado para aumentar a formação do ciclodecanos em e. coli13. O pacyc-Duet: o plasmídeo de ggpps/ZmAN2 contem o milho ent-copalyl difosfato sintase ZmAN2 e um sintase de GGPP de Abies grandis. As enzimas que catalisam as reações comprometidas na biossíntese de dolabralexin foram então transformadas em plasmídeos pET28b: ZmKSL4 e petduet: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. Para detalhes sobre sequências e construções de plasmídeo ver mafu et al. 201839. Um cromatograma GC-MS dos produtos enzimáticos extraídos é mostrado na Figura 3a, ilustrando a formação de três compostos de dolabralexina, a saber, o dolabradieno (1,2 ± 0,25 mg/l cultura), epoxydolabrene (0,65 ± 0,2 mg/l cultura), e epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L cultura) como quantificada com base em uma curva padrão usando o diterpenóide sclareol. O sclareol foi utilizado como padrão de referência, devido à sua estrutura semelhante e propriedades químicas em relação às dolabralexinas. Os subprodutos menores tipicamente observados incluem o cloranfenicol, o oxindol de derivados indol e o indol-5-aldeído, e o precursor do difosfato de difosfato (GGPP) (Figura 3). Indole geralmente representa o subproduto primário, mas não é mostrado aqui, devido ao seu tempo de retenção mais curto do que o atraso de solvente definido de 7 min para preservar a integridade do instrumento GC-MS. Fluxo de trabalho esquemático da produção de diterpenóides utilizando N. javanicaA Figura 4 retrata uma visão geral da expressão da via dolabralexina em N. javanica. Para os produtos aqui descritos, os seguintes constructos foram transformados separadamente em estirpe de a. tumefaciens GV3101: pLife33: P19 (expressando a proteína supressora de silenciamento de genes P19), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Seqüências nativas de comprimento total dos genes do trajeto do dolabralexin do milho foram usadas no vetor binário do T-ADN pLife3341 com resistência do canamicina para A propagação em e . coli e A. tumefaciens. A coexpressão dos genes de via terpenóide upstream é opcional, uma vez que o difosfato de difosfato precursor é formado endogenamente em N. benthamiana. Entretanto, diversos estudos empregaram com sucesso tais aproximações para aumentar a formação do ciclodecanos em N. javanica14,36,41. Como ilustrado na Figura 3, a coexpressão produziu com sucesso o dolabradiene e 15,16-epoxydolabrene. Diferentemente da coexpressão enzimática em E. coli, 15, 16-epoxydolabranol não foi detectada em extratos metabólito. A presença de 15,16-epoxydolabrene em extratos foliares demonstrou a atividade de CYP71Z18 em N. javanica. Como 15, 16-epoxydolabranol mostrou-se estável após a extração de culturas microbianas (Figura 3), bem como após o isolamento de tecidos de raízes de milho em estudos anteriores39, parece plausível que o produto hidroxilado é glicosilado por glicosiltransferases endógenas e subsequentemente seqüestrado no vacuol, tornando-o inacessível à extração com as misturas orgânicas do solvente usadas aqui para a extração36,43,44,45 ,46. Modificações de produto indesejáveis semelhantes no contexto da engenharia de vias em N. javanica foram relatadas em estudos anteriores47. Como mostrado para a coexpressão em E. coli, a expressão transitória em N. javanica resulta na extração de vários subprodutos, incluindo os alcanos lineares de comprimento de cadeia diferente como baseado na comparação com bases de dados de espectros de massa de referência. Os títulos compostos extraídos do material foliar foram encontrados em média 2,4 +/-0,5 mg dolabradiene e 0,9 +/-0,3 mg 15,16-epoxydolabrene por g tecido foliar seco. Estes títulos não podem ser comparados diretamente ao sistema da co-expressão de E. coli dado os diferentes set-ups experimentais. Purificação de diterpenoidA purificação do diterpenoid foi conseguida usando a cromatografia da coluna do silicone e a HPLC semipreparative subseqüente. Extratos metabólito de 12 L de culturas de E. coli agrupadas foram purificados utilizando cromatografia em coluna de sílica para separar os três compostos de dolabralexina focal (Figura 3a). A cromatografia de sílica é ideal para alcançar a alta pureza dos compostos alvo, uma vez que permite a separação simples de olefinas de diterpeno e derivados oxigenados, e remove prontamente o principal contaminante, o oxindol, que é retido na matriz de sílica ( Figura 3a). Figura 1: fluxo de trabalho para produção de diterpenóides em e . coli e purificação de metabolito de culturas bacterianas líquidas. As caixas tracejadas descrevem etapas opcionais onde a purificação adicional é exigida. (A) imagem representativa da cultura de E. coli extraída utilizando um funil separatório. (B) imagem representativa da purificação do extrato metabólito utilizando cromatografia de sílica.   Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: caminhos biossintéticos de Dolabralexin e construções genéticas utilizadas neste estudo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: resultados do GC-MS. São mostrados os cromatogramas GC-MS representativos de produtos purificados de diterpenóides obtidos por meio de ensaios de coexpressão enzimática em (A) e . coli e (B) N. javanica. As identificações de produto baseiam-se em comparações com padrões autênticos e espectros de massa de referência da biblioteca espectral de massa do Instituto Nacional de normas e tecnologia (NIST). 1, Oxindol; 2, indol-5-aldeído; 3, pyrrolo [1,2-a] pirazina-1,4-diona, hexahydro-3-(2-metilpropil)-; 4, 6-O-acetil-1-[[4-bromophenyl] THIO]-a-d-glucoside S, S-dióxido; 5, dolabradieno; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, pyrrolo [1,2-a] pirazina-1,4-diona, hexahydro-3-(fenilmetil)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 e 12, desconhecido; 10, cloranfenicol; 11, 3, 7, 11, 15-tetrametil-2-hexígeno-1-ol; 13-16, alkanes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: produção de Diterpenóides em N. benthamiana. (A) fluxo de trabalho de produção de diterpenóides em n. javanica e purificação de metabolito a partir de material foliar. (B) imagem representativa de plantas de n. javanica prontas para experimentos de infiltração, antes da poda. (C) imagens representativas de plantas de N. javanica após a poda. (D) imagem da seringa-folhas infiltradas. Áreas mais escuras foram infiltradas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A investigação e a aplicação mais amplas de produtos naturais de diterpenóides necessitam de protocolos simples e baratos para sintetizar e purificar quantidades suficientes de compostos desejados. O rápido aumento do número de enzimas diterpenóides-metabólicas disponíveis a partir de uma ampla gama de espécies agora fornece um inventário expansivo para a produção enzimática de diterpenóides usando sistemas hospedeiros microbianos e baseados em plantas. Além disso, a arquitetura modular de muitas vias diterpenóides permite o uso de enzimas da mesma espécie ou de diferentes espécies em ‘ plug & Play ‘ abordagens de engenharia combinatória para gerar uma matriz de natural e nova natureza-como diterpenóide natural produtos2,14,26,35.

E. coli é um hospedeiro microbiano preferencial para a biossíntese de produtos naturais devido à sua robustez, facilidade de escalabilidade, complexidade química limitada para contaminação por subprodutos reduzidos e a riqueza de ferramentas disponíveis para a montagem e expressão de DNA Otimização. Em nossa experiência, a plataforma descrita aqui é bem adequada para produzir rendimentos de produtos de até várias centenas de mg de olefinas de diterpeno e álcoois, o que é adequado para muitas aplicações a jusante, incluindo as propostas aqui. Apesar de não atender à escala industrial, a plataforma de produção descrita aqui pode servir como base para mais vias, acolhimento e otimização da fermentação, como foi demonstrado com sucesso para diterpenóides relacionados, como o taxadieno e o sclareol33 ,34. A sobreexpressão dos genes da via MVA ou MEP com limitação de taxa foi estabelecida com sucesso para superar fatores limitantes da produtividade para a biossíntese de diterpenóides, como suprimento insuficiente de precursor e fluxo precursor em vias concorrentes13, 32,33,39. Embora provado bem sucedido em diversos estudos, a expressão pobre e a atividade catalítica do P450s eucarióticas terpenoid-metabólico e de outras enzimas membrana-ligadas em e. coli são um fator de limitação provável33,39 ,48,49,50,51,52. O uso de seqüências Codon-aperfeiçoadas e de modificações da proteína, tais como a remoção do peptide endoplasmático do sinal do retículo ou a introdução de um peptide do sinal do núcleo, provaram útil aumentar a expressão do P450 solúvel14,38 ,49,50,53. Tais modificações também foram empregadas para a coexpressão microbiana do milho CYP71Z1839 utilizada como exemplo de via neste estudo. Os protocolos descritos baseiam-se no uso de plasmís que transportam um ou dois genes por construto, todos o mesmo promotor induzível. Onde as combinações de genes de maior escala são desejadas, é aconselhável usar várias gavetas de múltiplos genes disponíveis ou sistemas de empilhamento de genes para mitigar a eficiência de transformação reduzida e o crescimento da cultura devido ao uso de múltiplos plasmímicos e antibióticos13 .

Com a disponibilidade mais ampla de recursos genéticos e genômica, os sistemas hospedeiros de plantas também se tornam cada vez mais adequados para a fabricação de produtos naturais. As vantagens incluem a capacidade das plantas para produzir os precursores naturais exigidos pstos pela fotossíntese, assim permitindo a formação do produto sem a necessidade de complementar moléculas do precursor54,55. N. javanica já é amplamente utilizado para a caracterização funcional in vivo e expressão combinatória de terpenóides e outras vias de produto natural14,35,36,40 . As vantagens notáveis do uso de N. javanica como sistema hospedeiro incluem a produção endógena de precursores diterpenóides, o uso de sequências genéticas nativas, a expressão simplificada de P450s eucariótica, a facilidade de transformação genética combinatória (como os antibióticos separados não são exigidos para a cotransformação transiente), e a extração simples de produtos do alvo do material da folha. Quando necessário, a produção de diterpenóides pode ser reforçada através da coexpressão dos genes-chave da via do MEP para aumentar o suprimento precursor36,41. As restrições para a produção escalável de diterpenóides em N. javanica são mais complexas em comparação com as culturas microbianas líquidas, devido à necessidade de gerar biomassa vegetal suficiente, a purificação de produtos mais trabalhosa do complexo quimicamente tecido vegetal e possível metabolização indesejável de produtos-alvo através, por exemplo, de oxidação, glicosilação ou deposforilação por enzimas endógenas36,43,44,45 ,46,47. No entanto, este procedimento pode ser dimensionado até as quantidades do produto mg, aumentando o número de plantas utilizadas para agroinfiltração56.

Os protocolos de extração e purificação de produtos descritos aqui são compatíveis com e . coli e N. javanica, assim como S. cerevisiae e outros sistemas hospedeiros de plantas ou microbiana, e proporcionam uma abordagem econômica que é fácil de criado em laboratórios de biologia e química e não requer equipamento de purificação caro. A extração do metabolito usando um funil funil é apropriada para a extração eficiente e a separação da fase antes da purificação cromatográfica. Os tamanhos de funil podem ser prontamente ajustados para permitir volumes de cultura maiores e reduzir o tempo experimental necessário para extrair de grandes culturas. Encontramos o uso de um gradiente de hexano/acetato de etilo para ser ideal para a extração de diterpenóides de diferentes polaridade, como demonstrado aqui para o grupo de dolabralexinas que compõem os compostos hidrocarbônico e oxigenado (Figura 3). Dependendo das propriedades dos produtos-alvo, outras misturas de solventes podem ser vantajosas. No entanto, os solventes não devem ser miscível com água para garantir a extração bem-sucedida e separação de fase usando a técnica de funil separatório. Além disso, a perda de produto por evaporação deve ser levada em conta ao usar essa abordagem para a produção de compostos orgânicos voláteis (COV), como o menor peso molecular mono e sesqui-terpenóides e outros VOCs. A separação cromatográfica de diterpenóides de diferentes níveis de oxigenação usando uma coluna de sílica de maior escala (~ 2 L) tem sido vantajosa em nossa experiência, uma vez que proporciona uma melhor separação de produtos e minimiza a necessidade de purificação iterativa etapas ao usar volumes de coluna menores. Os volumes e matrizes das colunas podem ser ajustados conforme necessário para o volume de cultura desejado e o tipo de produto natural. A pureza dos produtos-alvo que podem ser alcançados usando este protocolo é adequada para muitas aplicações a jusante, tais como ensaios de Bioatividade ou para uso em análises de atividade enzimática. No entanto, onde os níveis de pureza mais elevados são necessários, tais como análises estruturais através de RMN, a pureza do produto pode ser eficientemente reforçada pela purificação adicional usando (semi)-HPLC preparative.

Este protocolo descrito aqui foi otimizado para a produção de produtos naturais diterpenóides, mas também pode ser prontamente personalizado para mono-, sesqui e Tri-terpenóides relacionados, bem como outras classes de produto natural, simplesmente gerando a enzima desejada módulos para a expressão combinatória14,57. No entanto, as modificações dos procedimentos de extração e purificação do produto devem ser levadas em consideração para compostos com maior volatilidade, como mono-e sesqui-terpenóides, ou maior polaridade e modificação funcional, como exemplificado por glicosilação de muitos triterpenoids, phenylpropanoids, e outras classes naturais do produto.

Embora as plataformas da industrial-escala para a manufatura de produtos naturais estejam disponíveis, os protocolos descritos aqui oferecem uma ferramenta barata, customizável que possa facilmente ser ajustada acima em a maioria de laboratórios. Como demonstrado pela produção de milho dolabralexins aqui e em outros lugares39, as quantidades do produto e pureza que podem ser alcançados usando esta abordagem são tipicamente suficientes para facilitar a análise de vários downstream e usos, incluindo, mas não limitado a, vários estudos de bioatividade, análise de interações entre organismos, bem como para uso como substratos enzimáticos ou como material de partida para abordagens de semisíntese.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nós reconhecemos agradecidamente Dr. Reuben Peters (Iowa State University, EUA) para fornecer os pIRS e pGGxZmAN2 construções. O apoio financeiro para este trabalho pelo programa de interações planta-biótica da NSF (Grant # 1758976 para P.Z.), o programa de pesquisa de carreira precoce DOE (Grant # DE-SC0019178 para P.Z.), o programa de ciência da Comunidade do Instituto genoma conjunto DOE (Grant # CSP2568 to P.Z.), o NSF Programa de bolsas de estudo de pós-graduação (para K.M.M.), e uma UC Davis Dean ‘ s mentorship Award Fellowship (para K.M.M.) são gratos.

Materials

1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent –
7890B GC Agilent –
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. a. n. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Tags

DiterpenoidNatural ProductMetaboliteEnzymatic ProductionPurificationCustomizable ApproachE. ColiCompetent CellsTransformationColony SelectionSmall CultureTerrific BrothPurification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image