هنا نقدم سهله الاستخدام بروتوكولات لإنتاج وتنقيه الأيض diterpenoid من خلال التعبير التوافقي من الانزيمات الاصطناعية في القولونية أو نيكوتيانا benthamiana، تليها المنتج الكروماتوغرافي تنقيه. نواتج الأيض الناتجة هي مناسبه للدراسات المختلفة بما في ذلك توصيف الهيكل الجزيئي ، والدراسات الوظيفية الانزيم ، واختبارات النشاط الحيوي.
Diterpenoids تشكل فئة متنوعة من المنتجات الطبيعية جزيء صغير التي يتم توزيعها علي نطاق واسع في جميع انحاء ممالك الحياة ولها وظائف بيولوجية حرجه في العمليات التنموية ، والتفاعلات إينتيرورجانيسمال ، والتكيف البيئي. نظرا لهذه الانشطه الحيوية المختلفة ، والعديد من diterpenoids هي أيضا ذات اهميه اقتصاديه مثل الادويه والمضافات الغذائية والوقود الإحيائي ، وغيرها من المنتجات الحيوية. وقد مكنت النهج المتقدمة علم الجينوم والبيوكيميائية زيادة سريعة في معرفه الجينات diterpenoid-الأيض ، والانزيمات ، والمسارات. ومع ذلك ، فان التعقيد الهيكلي للدوتيريا والتوزيع التصنيفي الضيق للمركبات الفردية في كثير من الأحيان لا يبقي الا نوعا واحدا من العوامل المقيدة لإنتاجها بكفاءة. توفر مجموعه واسعه من الانزيمات الايضيه الآن توفير الموارد لإنتاج الدتيربينييدات في الكميات الكافية والنقاء لتسهيل تحقيق أعمق لهذه المجموعة المستقلب الهامه. الاعتماد علي الاداات التي أنشئت لانزيم الميكروبية والنباتية التي تعتمد علي التعبير المشترك ، ونحن نقدم بروتوكول تعمل بسهوله وقابله للتخصيص للإنتاج الانزيمي من الدتيربينييدات في اما القولونية أو نيكوتيانا benthamiana، و تنقيه المنتجات المطلوبة عن طريق اللوني السيليكا وشبه الاعداديه HPLC. باستخدام مجموعه من الذرة (زيميس) dolabralexin diterpenoids كمثال ، ونحن تسليط الضوء علي كيفيه تركيبات وحدات من synthase diterpenoids (ditps) و سيتوكروم P450 اكسيجيناز أحاديه (P450) يمكن استخدام الانزيمات لتوليد السقالات diterpenoids مختلفه. ويمكن استخدام المركبات المنقية في مختلف التطبيقات المصب ، مثل التحليلات الهيكلية المستقلب ، والدراسات وظيفة هيكل الانزيم ، وفي المختبر وفي التجارب الحيوية النباتات.
[دتيربنيدس] يتالف مجموعه كيميائيا متنوعة من أكثر من 12,000 غالبا [بولدوري] [20-كربون] منتوجات طبيعيه ان يلعب ادوار حرجه في كثير كائن حي1. الفطريات والنباتات تنتج أكبر تنوع diterpenoids ، ولكن كما تبين البكتيريا لتشكيل diterpenoids النشطة بيولوجيا (انظر التعليقات2،3،4،5). الجذور في تنوعها الهيكلي الواسع ، وخدمه diterpenoids العديد من الوظائف البيولوجية. وهناك عدد قليل من diterpenoids ، مثل هرمونات النمو الجبريلين ، لديها وظائف أساسيه في العمليات التنموية5. ومع ذلك ، فان الغالبية العظمي من diterpenoids بمثابه وسطاء من الدفاع الكيميائي والتفاعلات إينتيرورجانيسمال. ومن بين هذه الأحماض الراتنج ديتيربيني في آلافات والممرض الدفاع من الأشجار الصنوبرية ويمزج الأنواع المحددة من ديتيربينييدات المضادة للميكروبات في المحاصيل الغذائية الرئيسية مثل الذرة (زيميس) والأرز (اوريزا ساتيفا) وقد تم علي نطاق واسع درست6,7. هذه الانشطه الحيوية توفير مستودع الكيميائية الغنية للتطبيقات التجارية ، واختيار diterpenoids تستخدم الادويه الهامه ، والمضافات الغذائية ، والمواد اللاصقة ، وغيرها من المنتجات الحيوية من الحياة اليومية الحديثة8،9 ،10. وللمضي قدما في البحوث المتعلقة بالتنوع الطبيعي والوظائف البيولوجية للدوريبينييدات ، وفي نهاية المطاف الترويج للتطبيقات التجارية الأوسع نطاقا ، يلزم توفير أدوات لاعداد المركبات النقية بكفاءة من حيث التكلفة. وقد وضعت العزلة علي نطاق واسع من المواد النباتية لعدد قليل من المنتجات الحيوية diterpenoid ، مثل الأحماض الراتنج diterpenoid التي يتم إنتاجها كمنتج ثانوي من صناعه اللب والورق8. ومع ذلك ، تراكم diterpenoids في انسجه محدده فقط وتحت التنظيم المحكم من قبل المحفزات البيئية في كثير من الأحيان يحد من العزلة من كميات المنتجات الكافية من المنتج الطبيعي2. الاضافه إلى ذلك ، فان التعقيد الهيكلي للديتيربنيدات يعوق إنتاجها من خلال التوليف الكيميائي ، علي الرغم من ان هذه النهج قد نجحت في العديد من الحالات11و12. مع توافر تقنيات الجينوم والكيمياء الحيوية المتقدمة ، وقد اكتسبت منصات الإنتاج الانزيميه اهتماما متزايدا لإنتاج مجموعه من المركبات diterpenoid (انظر التعليقات13،14، 15و16و17و18).
وتستمد جميع التربينات ، بما في ذلك الدتيربينييدات ، من اثنين من السلائف ايزوبرينواد الايزوميريه ، إيسوبينتينيل ثنائي فسفات (IPP) وديميثيلاليل ثنائي الفوسفات (dmapp)19 التي ، بدورها ، تتشكل من خلال الميلنات (المضافة) أو مسار ميثيل اريثريتول-5-الفوسفات. التخليق الحيوي تيرنويد العائدات من خلال مسار الطريق السريع في البكتيريا والطريق السريع للصناعة التحويلية في الفطريات ، في حين ان النباتات تمتلك المضافات الصحية السيتووليك ومسار البلازما ، مع ان الأخير هو الطريق الرئيسي نحو تشكيل diterpenoid20. التكثيف من IPP و dmapp من قبل الناقلات قبل الميلاد غله المركزية 20-الكربون السلائف لجميع دتيربينيدس ، جيرانيلجيرانيل ثنائي فسفات (ggpp)20. المصب من تشكيل ggpp ، واثنين من الأسر انزيم ، تربين synthases (tpss) و سيتوكروم P450 مونوكسيجيناسيس (P450s) السيطرة إلى حد كبير علي تشكيل التنوع الكيميائي واسعه من الأيض تربين21،22. ديتيربيني synthases (ditpss) تحفيز التزام القائم علي الكارميه المدفوعة وأعاده ترتيب ggpp لتشكيل مختلف المجسمات ثنائي ، بولي ، أو ماكرو دوري ديتيربيني السقالات1،3،23، 24-الآن ثم يتم تسهيل الأوكسجين والزخرفة الوظيفية الاضافيه لهذه السقالات بواسطة انزيمات P450 واختيار عائلات انزيم أخرى22،25. TPSs و P450s موجودة عاده الأنواع المحددة ، والأسر متعددة الجينات التي يمكن ان تشكل وحدات الشبكات الحيوية الاصطناعية ، حيث الجمع بين وحدات انزيم مختلفه علي طول مخطط مشترك يتيح تشكيل مجموعه واسعه من المركبات2، 26. الاكتشاف السريع من الانزيمات وظيفيا متميزة تعمل في مسارات تربين وحدات في السنوات الاخيره قد وفرت فرصا متزايدة لاستخدامها كقائمه أجزاء متعددة للهندسة الايضيه من مسارات جزئيه أو كامله في منصات الإنتاج الجرثومية والنباتية علي حد سواء. علي سبيل المثال ، تم تطبيق الخميرة (ساكاروميسز سيريفيسياي) بنجاح لمهندس مسارات متعددة الانزيمات لتصنيع المنتجات الحيوية تربين ، مثل ماده الارتيميسينين المخدرات المضادة للملاريا27، و سيسكويتيربينويد الوقود الإحيائي bisابولي و farnesene28، ولكن أيضا اختيار ديتيربينيادس29،30،31. المثل ، تم إنشاء منصات القولونية الهندسية للصناعة علي نطاق صناعي لعدد قليل من الأيض diterpenoid ، بما في ذلك تاكساديني السلائف taxol المستخدمة كدواء مضاد للسرطان والكحول diterpenoid ، الصلبة ، وتستخدم في صناعه العطور13،32،33،34. كما ان التقدم في الهندسة الوراثية وتكنولوجيات التحول جعلت النظم المضيفة للنباتات قابله للاستمرار علي نحو متزايد لإنتاج المنتجات الطبيعية النباتية9و14و35و36. علي وجه الخصوص ، أصبح القريب التبغ وثيق ، نيكوتيانا benthamiana، هيكل المستخدمة علي نطاق واسع لتحليل المسار تربين والهندسة ، ويرجع ذلك إلى سهوله التحول بوساطة agrobacteriumمن مجموعات الجينات متعددة ، التخليق الحيوي الفعال للسلائف الذاتية ، والكتلة الاحيائيه العالية14،35،36.
الرسم علي هذه المنصات التي أنشئت لتخليق الحيوي تربين ، ونحن وصفها هنا سهله الاستخدام وأساليب فعاله من حيث التكلفة للإنتاج الانزيمي من ديتيربينييدس وتنقيه المركبات واحد. البروتوكولات المقدمة توضح كيف يمكن استخدام المنصات e. القولونية و n. benthamiana المهندسة لتعزيز التخليق الحيوي السلائف diterpenoid للتعبير التوافقي لمختلف ditpss و P450 الانزيمات لتوليد المطلوب المركبات diterpenoid. ويظهر تطبيق هذا البروتوكول لإنتاج وتنقيه ديتيربينييدات المختلفة من الناحية الهيكلية علي سبيل المثال من الديتيربينييدات المتخصصة من الذرة (زيميس) ، وتسمي dolabralexins ، التخليق الحيوي الذاتية التي تجند اثنين من ditps واحد P450 انزيم. ومن ثم يتحقق تنقيه dolabralexins مختلفه تتراوح من اوليفينات إلى مشتقات الأوكسيجين عن طريق الجمع بين استخراج القمع المنفصلة مع الفصل اللوني السيليكا علي نطاق واسع والفصل اللوني السائل عالي الضغط المعد (HPLC). البروتوكولات الموصوفة هي الأمثل لإنتاج الدتيربينييدات ، ولكن يمكن أيضا ان تتكيف بسهوله لفئات تربين ذات الصلة ، فضلا عن المنتجات الطبيعية الأخرى التي موارد الانزيم المتاحة. المركبات المنتجة باستخدام هذا النهج هي مناسبه لمختلف التطبيقات المصب, بما في ذلك ولكن لا تقتصر علي, توصيف الهيكلية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحليل, استخدام ركائز للدراسات الوظيفية الانزيم, ومجموعه من اختبارات النشاط الحيوي.
توسيع نطاق التحقيق وتطبيق المنتجات الطبيعية diterpenoid يتطلب بروتوكولات بسيطه وغير مكلفه لتوليف وتنقيه كميات كافيه من المركبات المطلوبة. الزيادة السريعة في عدد من الانزيمات الايضيه diterpenoid المتاحة من مجموعه واسعه من الأنواع الآن يوفر مخزون توسعيه للإنتاج الانزيمي من diterpenoid باستخدام الميكروبية والنباتية القائمة علي أنظمه المضيف. الاضافه إلى ذلك ، فان الهندسة المعمارية وحدات من العديد من مسارات diterpenoid تمكن من استخدام الانزيمات من نفس الأنواع أو مختلفه في ‘ التوصيل & اللعب ‘ نهج الهندسة التوافقية لتوليد مجموعه من الطبيعة الطبيعية والجديدة مثل diterpenoid الطبيعية المنتجات2،14،26،35.
E. كولاي هو المضيف الميكروبي المفضل لتخليق المنتجات الطبيعية بسبب قوتها ، وسهوله التحجيم ، والتعقيد الكيميائي محدوده لانخفاض التلوث الثانوي ، وثروة من الاداات المتاحة لتجميع الحمض النووي والتعبير الامثل. في تجربتنا ، المنصة الموصوفة هنا هي مناسبه تماما لإنتاج غله المنتج تصل إلى عده مئات من الملغ من اوليفينات ديتيربين والكحول ، والتي هي مناسبه للعديد من التطبيقات المصب بما في ذلك تلك المقترحة هنا. في حين لا يجتمع النطاق الصناعي ، ومنصة الإنتاج الموصوفة هنا يمكن ان تكون أساسا لمزيد من المسار ، والمضيف ، والتخمير الأمثل كما ثبت بنجاح ل diterpenoids ذات الصلة مثل تاكساديني والصلبة33 ,34. وقد تم بنجاح إنشاء التعبير المفرط عن الجينات التي تحد من المعدلات المضافة للصناعة التحويلية أو المسالك المتوسطة للتغلب علي العوامل التي تحد من الغلة بالنسبة لتخليق المركبات الحيوية ، مثل عدم كفاية إمدادات السلائف وتدفق السلائف إلى المساراتالمتنافسة 13 ، 32،33،39. علي الرغم من ان ثبت نجاحه في العديد من الدراسات ، وضعف التعبير والنشاط الحفاز من تربين-الأيض P450s النواة وغيرها من الانزيمات الغشائية في القولونية هو عامل الحد من المرجح33،39 ،48،49،50،51،52. وقد ثبت استخدام متواليات codon الأمثل والتعديلات البروتين ، مثل أزاله الببتيد اشاره الشبكية إندوبلازمي أو إدخال الببتيد اشاره plastidial ، مفيده لزيادة ذوبان P450 التعبير14،38 ،49،50،53. واستخدمت هذه التعديلات أيضا للتعبير الميكروبي المشترك للذرة CYP71Z1839 المستخدم كمثال للمسار في هذه الدراسة. وتستند البروتوكولات الموصوفة علي استخدام البلازميدات الذي يحمل واحدا أو اثنين من الجينات لكل بناء ، وجميعها تحت نفس المروج المحرض. وفي الحالات التي تكون فيها التركيبات الجينية الأوسع نطاقا مرغوبة ، فانه من المستصوب استخدام مختلف الشرائط الجينية المتعددة المتاحة أو نظم التراص الجينية للتخفيف من كفاءه التحول المنخفض ونمو الثقافة بسبب استخدام البلازميدات ومضادات حيوية متعددة13 .
ومع توافر الموارد الوراثية والجينوم علي نطاق أوسع ، أصبحت النظم المضيفة للنباتات أيضا مناسبه بشكل متزايد لتصنيع المنتجات الطبيعية. وتشمل المزايا قدره النباتات علي إنتاج السلائف الطبيعية المطلوبة مدعومة بالتمثيل الضوئي ، التالي تمكين تكوين المنتجات دون الحاجة إلى تكمله السلائف جزيئات54،55. N. benthamiana يستخدم بالفعل علي نطاق واسع لفي الجسم الطبيعي توصيف وظيفية والتعبير التوافقي من تربين وغيرها من مسارات المنتجات الطبيعة14,35,36,40 . وتشمل المزايا الملحوظة لاستخدام n. benthamiana كنظام مضيف الإنتاج الذاتية من السلائف diterpenoid ، واستخدام متواليات الجينات الاصليه ، والتعبير المبسط لP450s حقيقية النواة ، وسهوله التحول الجينات التوافقية (كما المضادات الحيوية منفصلة غير مطلوبه للتحول المشترك عابره) ، واستخراج بسيطه من المنتجات المستهدفة من المواد ورقه. عند الحاجة ، ويمكن تعزيز إنتاج diterpenoid من خلال التعبير المشترك من الجينات المسار الأساسي لزيادة السلائف العرض36،41. القيود المفروضة علي إنتاج diterpenoid قابله للتطوير في n. benthamiana هي أكثر تعقيدا بالمقارنة مع الثقافات الميكروبية السائلة بسبب الحاجة إلى توليد الكتلة الحيوية النباتية كافيه ، وأكثر كثافة العمالة الكثيفة تنقيه المنتجات من مركب كيميائيا الانسجه النباتية ، وامكانيه الأيض غير المرغوب فيها من المنتجات المستهدفة من خلال ، علي سبيل المثال ، الاكسده ، glycosylation أو ديفوسفورويليشن من قبل الانزيمات الذاتية36،43،44،45 ,46,47. ومع ذلك ، يمكن توسيع هذا الاجراء إلى كميات المنتج مغ عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة للتسلل الزراعي56.
بروتوكولات استخراج وتنقيه المنتجات الموصوفة هنا متوافقة مع e. كولاي و n. benthamiana، وكذلك s. سيريفيسياي وغيرها من النظم المضيفة النباتية أو الميكروبية ، وتوفير نهج فعاله من حيث التكلفة التي من السهل ان أنشئت في كل من مختبرات البيولوجيا والكيمياء ولا تتطلب معدات تنقيه باهظه الثمن. استخراج المستقلب باستخدام قمع منفصلة مناسبه تماما لاستخراج كفاءه وفصل المرحلة قبل تنقيه الكروماتوغرافي. ويمكن تعديل احجام القمع بسهوله للسماح بحجم أكبر للثقافة وتقليل الوقت التجريبي اللازم لاستخراجها من الثقافات الكبيرة. وجدنا استخدام التدرج خلات الهكسان/ايثيل لتكون مثاليه لاستخراج ديتيربنيدس من قطبيه مختلفه كما هو موضح هنا لمجموعه من dolabralexins التي تضم كلا من الهيدروكربونات والأوكسيجين المركبات (الشكل 3). اعتمادا علي خصائص المنتجات المستهدفة ، قد تكون الخلائط المذيبات الأخرى مفيده. ومع ذلك ، يجب الا تكون المذيبات بالماء لضمان الاستخراج الناجح وفصل المرحلة باستخدام تقنيه القمع المنفصلة. الاضافه إلى ذلك ، فان فقدان المنتج من خلال التبخر يجب ان يؤخذ في الاعتبار عند استخدام هذا النهج لإنتاج المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) ، مثل الوزن الجزيئي المنخفض أحاديه-و sesqui-تربين وغيرها من VOCs. فصل الكروماتوغرافي من ديتيربينيادس من مستويات مختلفه من الأوكسجين باستخدام أكبر مقياس (~ 2 L) عمود السيليكا كان مفيدا في تجربتنا ، لأنه يوفر فصل المنتجات المحسنة ويقلل من الحاجة إلى تنقيه تكراريه خطوات عند استخدام وحدات تخزين أصغر في العمود. يمكن تعديل وحدات تخزين الاعمده والمصفوفات حسب الحاجة لحجم الثقافة المطلوب ونوع المنتج الطبيعي. نقاء المنتجات المستهدفة التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول هو مناسبه للعديد من التطبيقات المصب ، مثل اختبارات النشاط الحيوي أو لاستخدامها في تحليلات نشاط الانزيم. ومع ذلك ، حيث مستويات نقاء اعلي مطلوبه ، مثل التحليلات الهيكلية عن طريق NMR ، ويمكن تعزيز نقاء المنتج بكفاءة عن طريق تنقيه اضافيه باستخدام (شبه)-الاعداديه HPLC.
هذا البروتوكول الموصوف هنا قد تم الأمثل لإنتاج المنتجات الطبيعية diterpenoid ، ولكن يمكن أيضا ان تكون مخصصه بسهوله إلى أحاديه ذات الصلة ، sesqui-وثلاثي التربين ، فضلا عن غيرها من فئات المنتجات الطبيعية ببساطه عن طريق توليد الانزيم المطلوب وحدات للتعبير التوافقي14،57. ومع ذلك ، يجب ان تؤخذ التعديلات علي إجراءات استخراج المنتج وتنقيه في الاعتبار للمركبات ذات التقلبات العالية ، مثل أحاديه و sesqui-تربين ، أو اعلي القطبية والتعديل الوظيفي علي النحو الذي يجسده الغليكولات من العديد من triterpenoids ، فينيلبروبانيدس ، وغيرها من فئات المنتجات الطبيعية.
وعلي الرغم من ان المنصات الصناعية لتصنيع المنتجات الطبيعية متاحه ، فان البروتوكولات الموصوفة هنا توفر أداه غير مكلفه وقابله للتخصيص يمكن اعدادها بسهوله في معظم المختبرات. كما يتضح من إنتاج dolabralexins الذرة هنا وأماكن أخرى39، وكميات المنتجات والنقاء التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا النهج هي عاده ما تكون كافيه لتسهيل التحليل المصب المختلفة والاستخدامات ، بما في ذلك ، ولكن ليس تقتصر علي ، والدراسات الحيوية المختلفة ، وتحليل التفاعلات بين الكائنات الحية ، وكذلك لاستخدامها كركائز الانزيم أو كماده البداية للنهج شبه التوليف.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نعترف بامتنان الدكتور روبن بيترز (جامعه ولاية أيوا ، الولايات الامريكيه) لتوفير الإنشاءات pIRS و pGGxZmAN2. الدعم المالي لهذا العمل من قبل برنامج التفاعلات النباتية الحيوية NSF (منحه # 1758976 إلى P.Z.) ، والكيان التشغيلي القديم برنامج البحوث المهنية (منحه # DE-SC0019178 إلى P.Z.) ، ومعهد الجينوم المشترك للمعهد برنامج العلوم المجتمعية (منحه # CSP2568 إلى P.Z.) ، NSF برنامج زمالات البحوث العليا (إلى K.M.M.) ، وزمالة جامعه كاليفورنيا ديفيس عميد جائزه الإرشاد (إلى K.M.M.) ومن المسلم به بامتنان.
1020 Trays | Greenhouse Megastore | CN-FLHD | |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M8250-500g | MES |
4" Tech Square Pot | McConkey Wholesale Grower's Supply | JMCTS4 | |
5977 Extractor XL MS | Agilent | – | |
7890B GC | Agilent | – | |
Acetonitrile | Sigma | 271004 | |
Agar | Fisher | BP1423-2 | |
Bacterial yeast extract | Fisher | BP9727-2 | |
Beaker | CTechGlass | BK-2001-015B | |
Cap, 9 mm blue screw, PFTE | Agilent | 5185-5820 | GC vial cap |
Carbenicillin | Genesee | 25-532 | Carb |
Chloramphenicol | Fisher | 50247423 | Chlor |
Chromatography column | CTechGlass | CL-0015-022 | |
Clear humidity dome | Greenhouse Megastore | CN-DOME | |
ColiRollers Plating Beads | Sigma | 71013 | Glass beads |
CoorsTek Porcelain Mortars | Fisher | 12-961A | mortar |
CoorsTek Porcelain Pestles | Fisher | 12-961-5A | pestle |
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride | Sigma | 50981039 | Aminoleuvolinic acid |
Ethanol | Fisher | A962-4 | EtOH |
Ethyl acetate | Fisher | E1454 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | Falcon tubes |
Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | cuvette |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | petri dish |
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks | Fisher | 05-541 | microtube rack |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Glycerol | Fisher | G33-500 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 (CS) | |
HP-5MS | Agilent | 19091S-433 | GC column |
Inlet adapter | CTechGlass | AD-0006-003 | glass inlet adapter |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher | BP1755-100 | IPTG |
Kanamycin | Fisher | BP9065 | Kan |
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase | VWR | 60825-798 | breathable test tube lids |
Magnesium chloride | Acros | 223210010 | MgCl2 |
Magnesium sulfate | Sigma | M7506-500g | MgSO4 |
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2756810 | |
Mixer Mill MM 200 | Retsch | 20.746.0001 | tissue mill |
Nalgene Fernbach culture flask | Sigma | Z360236 | 2.8 L flask |
New Brunswick I26 | Eppendorf | M1324-0000 | Shaking incubator |
Nicotiana benthamiana seed | USDA Germplasm Repository | Accession TW16 | N. benthamiana |
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells | Lucigen | 60442 | C41-DE3 cells |
Parafilm M wrapping film | Fisher | S37440 | Parafilm |
Potassium chloride | Sigma | P-9541 | KCl |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | P288-3 | Dipotassium phosphate |
Potassium phosphate monobasic | Monopotassium phosphate | ||
Pyrex disposable culture tubes, rimless | Sigma | CLS9944516 | test tubes |
Pyruvate Acid Sodium Salt | Fisher | 501368477 | Sodium pyruvate |
Retort Ring Stands | CTechGlass | ST00 | ring stand |
Riboflavin | Amresco | 0744-250g | |
Rifampicin | Sigma | R7382 | Rif |
Rotovap | |||
Sand, 50-70 mesh particle size | Sigma | 274739-1KG | |
Silica | Fisher | AC241660010 | silica gel |
Sodium chloride | Fisher | 5271-3 | NaCl |
Sodum hydroxide | Fisher | SS266-1 | NaOH |
Spectinomycin | Fisher | 501368607 | Spec |
Squibb Separatory Funnel | CTechGlass | FN-1060-006 | Separatory funnel |
Sunshine Mix #1 | Sungro Horticulture | Potting soil | |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher | 21-402-902 | microtube |
Triangle funnel | CTechGlass | FN-0035 | funnel |
Tryptone | Fisher | BP14212 | |
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn | Agilent | 5182-0716 | GC vial |
visible spectrophotometer, V-1200 | VWR | 634-6000P | spectrophotometer |
ZORBAX Eclipse XDB-C18 | Agilent | 990967-202 | HPLC column |
ZORBAX Eclipse XDB-CN | Agilent | 990967-905 | HPLC column |