JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Published: October 04, 2019
doi:
10.3791/59992
, , , , ,
1Department of Plant Biology,University of California Davis

Summary

Hier presenteren we gemakkelijk te gebruiken protocollen voor het produceren en zuiveren van diterpenoid metabolieten door de combinatorische expressie van biosynthetische enzymen in Escherichia coli of Nicotiana benthamiana, gevolgd door chromatografische product Zuivering. De resulterende metabolieten zijn geschikt voor verschillende studies, waaronder moleculaire structuur karakterisering, enzym functionele studies, en bioactiviteitentesten.

Abstract

Diterpenoids vormen een gevarieerde klasse van kleine moleculen natuurlijke producten die op grote schaal verdeeld over de koninkrijken van het leven en hebben kritische biologische functies in ontwikkelingsprocessen, interorganismale interacties, en milieu-aanpassing. Door deze verschillende bioactiviteiten zijn veel diterpenoïden ook van economisch belang als farmaceutische producten, levensmiddelenadditieven, biobrandstoffen en andere bioproducten. Geavanceerde Genomics en biochemische benaderingen hebben gezorgd voor een snelle toename van de kennis van diterpenoid-metabole genen, enzymen en trajecten. De structurele complexiteit van diterpenoïden en de nauwe taxonomische verdeling van afzonderlijke verbindingen in vaak slechts één soort blijven echter de factoren voor hun efficiënte productie beperken. De beschikbaarheid van een breder scala van metabole enzymen biedt nu middelen voor het produceren van diterpenoïden in voldoende Antilichaamtiters en zuiverheid om een dieper onderzoek van deze belangrijke metaboliet groep mogelijk te maken. Op basis van gevestigde hulpmiddelen voor microbiële en plantaardige enzym co-expressie, presenteren wij een gemakkelijk bediend en aanpasbaar protocol voor de enzymatische productie van diterpenoïden in zowel Escherichia coli als Nicotiana benthamiana, en de zuivering van de gewenste producten via silica chromatografie en semi-preparatieve HPLC. Met behulp van de groep van maïs (Zea mays) dolabralexin diterpenoids als voorbeeld, we benadrukken hoe modulaire combinaties van diterpeen synthase (ditps) en cytochroom P450 monooxygenase (P450) enzymen kunnen worden gebruikt voor het genereren van verschillende diterpenoid steigers. Gezuiverde verbindingen kunnen worden gebruikt in verschillende downstream toepassingen, zoals structurele analyses van de metaboliet, enzym structuur-functie studies, en in vitro en in planta bioactiviteit experimenten.

Introduction

Diterpenoids bestaat uit een chemisch diverse groep van meer dan 12.000 overwegend polycyclische 20-koolstof natuurlijke producten die een cruciale rol spelen in vele organismen1. Schimmels en planten produceren de grootste diversiteit van diterpenoïden, maar bacteriën hebben ook aangetoond dat ze bioactieve diterpenoïden vormen (Zie beoordelingen2,3,4,5). Geworteld in hun enorme structurele diversiteit, dienen diterpenoids een veelheid aan biologische functies. Een paar diterpenoids, zoals gibberellin groei hormonen, hebben essentiële functies in ontwikkelingsprocessen5. Echter, de meerderheid van diterpenoids dienen als bemiddelaar van chemische verdediging en interorganismale interacties. Onder deze, diterpeen harszuren in de plaag en pathogenen verdediging van naaldbomen en soortspecifieke mengsels van antimicrobiële diterpenoïden in grote voedselgewassen zoals maïs (Zea mays) en rijst (Oryza sativa) zijn het meest uitgebreid heeft6,7. Deze bioactiviteiten bieden een rijke chemische opslagplaats voor commerciële toepassingen, en selecteer diterpenoids worden gebruikt als belangrijke farmaceutische producten, levensmiddelenadditieven, lijmen, en andere Bioproducts van de dagelijkse moderne leven8,9 ,10. Om verder onderzoek te doen naar de natuurlijke diversiteit en biologische functies van diterpenoïden en uiteindelijk bredere commerciële toepassingen te bevorderen, zijn instrumenten nodig voor de kostenefficiënte bereiding van zuivere verbindingen. Grootschalige isolatie van plant materiaal is vastgesteld voor een paar diterpenoid Bioproducts, zoals diterpeen-harszuren die worden geproduceerd als bijproduct van de pulp-en papierindustrie8. Accumulatie van diterpenoïden in alleen specifieke weefsels en onder strakke regulering door milieu stimuli beperkt echter vaak de isolatie van voldoende producthoeveelheden van de natuurlijke producent2. Bovendien belemmert de structurele complexiteit van diterpenoids hun productie door middel van chemische synthese, hoewel dergelijke benaderingen in verschillende gevallen11,12succesvol zijn geweest. Met de beschikbaarheid van geavanceerde genomische en biochemische technologieën, hebben enzymatische productie platformen steeds meer aandacht gekregen voor het produceren van een reeks diterpenoid verbindingen (Zie beoordelingen13,14, 15,16,17,18).

Alle terpenen, met inbegrip van diterpenoïden, zijn afgeleid van twee isomere isoprenoid-precursoren, isopentenylpyrofosfaat-difosfaat (IPP) en dimethylallyldifosfaat (DMAPP)19 , die op hun beurt worden gevormd door het mevalonaat (MVA) of de methylerythritol-5-fosfaat (MEP) pathway. Terpenoid biosynthese verloopt via het MEP-traject in bacteriën en de MVA-route in schimmels, terwijl planten een cytosolische MVA en een plastidial MEP-traject bezitten, waarbij de laatste de primaire route is naar diterpenoid formatie20. Condensatie van IPP en DMAPP door prenyl-transferasen levert de centrale 20-koolstof precursor voor alle diterpenoïden, geranylgeranyl difosfaat (GGPP)20. Stroomafwaarts van de vorming van ggpp beheersen twee enzym families, terpeen synthases (tpss) en cytochroom P450 monooxygenasen (P450s) grotendeels de vorming van de enorme chemische diversiteit van terpeen metabolisme21,22. Diterpeen synthases (ditpss) katalyseert de betrokken carbocation-gestuurde cyclisering en herschikking van ggpp om verschillende stereospecifieke bi-, poly-of macro-cyclische diterpeen steigers te vormen1,3,23, 24. Oxygenatie en verdere functionele decoratie van deze steigers wordt vervolgens vergemakkelijkt door de P450-enzymen en selecteer andere enzym families22,25. TPSs en P450s bestaan gewoonlijk als soortspecifieke, multi-Gene families die modulaire biosynthetische netwerken kunnen vormen, waarbij het combineren van verschillende enzym modules langs een gemeenschappelijke blauwdruk de vorming van een breed scala aan verbindingen2mogelijk maakt, 26. de snelle ontdekking van functioneel verschillende enzymen die in de afgelopen jaren in modulaire terpeen trajecten werkzaam zijn, heeft de uitbreiding van de mogelijkheden voor het gebruik ervan als een veelzijdige onderdelenlijst voor metabole engineering van gedeeltelijke of volledige trajecten in zowel microbiële als plantaardige productie platformen. Bijvoorbeeld, gist (Saccharomyces cerevisiae) is toegepast met succes te ingenieur Multi-enzym trajecten voor de vervaardiging van terpeen Bioproducts, zoals de anti-malaria drug artemisinine27, de sesquiterpeen biobrandstoffen bisaboleen en farnesene28, maar ook selecteren diterpenoids29,30,31. Evenzo zijn Engineered Escherichia coli -platformen voor de vervaardiging op industriële schaal vastgesteld voor een paar diterpenoid metabolieten, waaronder de voorloper van taxol taxadiene die wordt gebruikt als anti-kanker medicijn en de diterpeen alcohol, Sclareol , gebruikt in de geur industrie13,32,33,34. Ook vooruitgang in genetische manipulatie en transformatietechnologieën hebben installaties voor de productie van plantaardige producten steeds levensvatbaar gemaakt voor het produceren van plantaardige natuurlijke produkten9,14,35,36. In het bijzonder, de nauwe tabak familielid, Nicotiana benthamiana, is uitgegroeid tot een veelgebruikte chassis voor terpeen pathway analyse en engineering, als gevolg van het gemak van Agrobacterium-gemedieerde transformatie van meerdere gen combinaties , efficiënte biosynthese van endogene precursoren, en hoge biomassa14,35,36.

Tekening op deze gevestigde platforms voor terpeen biosynthese, beschrijven we hier eenvoudig te gebruiken en kostenefficiënte methoden voor de enzymatische productie van diterpenoids en de zuivering van enkelvoudige verbindingen. De gepresenteerde protocollen illustreren hoe E. coli en N. benthamiana platforms ontwikkeld voor verbeterde diterpenoid precursor biosynthese kan worden gebruikt voor de combinatorische uitdrukking van verschillende ditpss en P450 enzymen om te genereren gewenste diterpenoid verbindingen. Toepassing van dit protocol om structureel verschillende diterpenoïden te produceren en te zuiveren wordt aangetoond door een voorbeeld van gespecialiseerde diterpenoïden uit maïs (Zea mays), dolabralexinen genoemd, endogene biosynthese waarvan twee ditp’s en een P450 Enzym. Zuivering van verschillende dolabralexines variërend van olefinen tot zuurstofrijk derivaten wordt vervolgens bereikt door het combineren van separatory trechter extractie met grootschalige silica Kolomchromatografie en preparatieve hogedrukvloeistof chromatografie (HPLC). De beschreven protocollen zijn geoptimaliseerd voor de productie van diterpenoïden, maar kunnen ook gemakkelijk worden aangepast voor gerelateerde terpeen klassen, evenals andere natuurlijke producten waarvoor enzym bronnen beschikbaar zijn. Met deze aanpak geproduceerde verbindingen zijn geschikt voor verschillende downstreamtoepassingen, waaronder, maar niet beperkt tot, structurele karakterisering via nucleaire magnetische resonantie (NMR) analyse, gebruik als substraten voor enzym functionele studies en een reeks bioactiviteit assays.

Protocol

Let op: de hier beschreven protocollen omvatten het gebruik van gevaarlijke chemicaliën, scherpe voorwerpen, elektrische apparaten, hete voorwerpen en andere gevaren die kunnen resulteren in letsel. Er moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen en de juiste veiligheidsprocedures, met inbegrip van veiligheidstrainingen, moeten worden gevolgd. 1. voorbereiding van materialen en oplossingen Bereid en autoclaaf lysogeny Bouillon medium (LB) gedurende 30 minuten: per 1 L medium, meng 10 g Tryptone, 5 g bacterieel gistextract en 10 g NaCl en los op in 1 L gedeïoniseerd (DI) water. Voor 1 L co-expressie culturen, bereiden en autoclaaf geweldige Bouillon (TB) medium voor 30 min: in een erlenmeyer 2,8 L mengsel 12 g Tryptone, 24 g bacteriële gistextract, en 40 mL 10% (v/v) glycerol en ontbinden in 860 mL DI water. Bereid en autoclaaf 1,3 L van 10x fosfaatbuffer [1,3 L van di water, 30,03 g Monokalium fosfaat (KH2po4) en 163,02 g dikaliumfosfaat (K2HPO4)] en voeg toe aan het bovenstaande medium. Bereid Super optimale bouillon met Catabolite repressie (SOC) media. Bereid en autoclaaf gedurende 30 minuten een oplossing met 2% (w/v) Tryptone, 0,5% (w/v) bacterie gistextract, 8,5 mM NaCl en 2,5 mM KCl. Voeg steriel MgSO4 en glucose toe, beide met een eindconcentratie van 20 mm. Gebruik 1 M NaOH om aan te passen aan pH 7,0. Bewaar de SOC-media bij-20 °C. Bereid 1 L van 1 M natrium pyruvate. Autoclaaf gedurende 15 minuten en bewaren bij 4 °C. Bereid 20 mL 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in steriel DI water. Bewaar 1 – 2 mL aliquots bij-20 °C. Bereiding infiltratie buffer: 10 mM MES (1,952 g) en 10 mM MgCl2 (2,033 g) opgelost in 1 L di water. Bewaren bij 4 °C. Bereid en autoclaaf LB agar gedurende 30 min: per 100 mL DI water, voeg 1 g Tryptone, 0,5 g bacteriële gistextract, 1 g NaCl en 1,5 g agar toe. Eenmaal LB agar is koel genoeg om de fles te behandelen, voeg antibiotica zoals vereist voor de gewenste plasmide combinaties. Giet agar borden met petrischaaltjes en bewaar op 4 °C. Zie tabel 1 voor specificaties met betrekking tot samengestelde productie in E. coli en N. benthamiana, respectievelijk. Wikkel platen met rifampicine in folie om afbraak bij opslag te voorkomen. Werkconcentratie (μg/mL) Antibioticum Voorraad (mg/mL) Oplosmiddel 1 plasmide 2 plasmiden 3 of 4 plasmiden Carbenicillin 50 H2O 50 25 20 Chlooramfenicol 30 EtOH 30 20 20 Kanamycine 50 H2O 50 25 20 Spectinomycine 30 H2O 30 25 20 Gentamycine 50 H2O 30 Rifampicine 10 MeOH 10 Tabel 1: antibiotica concentraties voor plasmide co-expressie in E. coli of N. benthamiana. 2. productie van diterpenoid metabolieten in E. coli Opmerking: het hier beschreven protocol voor de productie van diterpenoid metabolieten in E. coli is aangepast van een eerder gerapporteerd enzym co-Expression platform ontwikkeld door de groep van Dr. Reuben J. Peters (Iowa State University, IA, USA)13 ,32. Transformatie van competente cellen met plasmide combinaties. Ontdooien chemisch competente E. coli cellen op ijs (BL21DE3-C41 cellen werden gebruikt in dit Protocol). Voeg 1 μL van een 100 ng/μL-oplossing van elke constructie die voor co-expressie wordt gebruikt toe aan 25 μL van de bevoegde cellen in een micro buisje van 1,5 mL. Niet Vortex of mengen door Pipetteer.Opmerking: voor een optimale expressie en activiteit van TPS-en P450-enzymen moeten verschillende sequentie wijzigingen worden overwogen. Voor TPS is het vaak essentieel om de N-Terminal plastidial transit peptide te verwijderen. Specifiek, plastidial mono-en di-TPS vereisen meestal verwijdering van de voorspelde transit peptide (met behulp van veelgebruikte Voorspellings algoritmen37), terwijl cytosolische SESQUI-TPS meestal kan worden gebruikt als volledige genen. Met betrekking tot P450s, codon optimalisatie en verwijdering of vervanging met de Leader sequence makktsskgk van de N-Terminal transmembraan domein is effectief gebleken in veel gevallen38,39. Bovendien, wanneer co-uitdrukken van P450 enzymen een cytochroom P450-reductase (CPR) moet worden opgenomen om te zorgen voor voldoende P450-activiteit. Inbroed het mengsel op ijs gedurende 30 min. Meng elke 10 minuten door de buis voorzichtig over een microtube rek te schrapen. Pre-Incubate SOC-media en LB agar-platen bij 37 °C die antibiotica bevatten, zoals vereist voor de gewenste combinatie van constructies.Opmerking: elke te co-getransformeerde constructie moet een uitgesproken antibioticaresistentie hebben, evenals een afzonderlijke oorsprong van replicatie om een optimale eiwit expressie te garanderen. Verhit het celmengsel bij 42 °C gedurende 1 minuut en inbroed vervolgens op ijs gedurende ten minste 2 minuten. Voeg 200 μL warme SOC-media toe. Schud het celmengsel gedurende 1 uur bij 37 °C en 200 rpm. Voeg ongeveer 10 geautoclaveerd glas parels toe aan de opgewarmde LB agar plaat. Voeg 100 μL van het celmengsel toe en vervang het deksel. Schud de plaat horizontaal met het deksel aan om de cellen gelijkmatig te verdelen. Verwijder de glas parels door ze af te tikken in een afvalbak. U ook andere voorkeurs beplating methoden gebruiken. Incuberen de LB agar plaat bij 37 °C ‘s nachts met het gecoate oppervlak naar beneden. De plaat met getransformeerde E. coli kolonies kan de volgende dag worden gebruikt of bewaard bij 4 °c, verzegeld in paraffine folie gedurende maximaal 2 weken. Bereiding van de inoculatie culturen Bereid op de volgende dag een oplossing van LB medium met antibiotica die nodig zijn voor de getransformeerde plasmide combinatie met behulp van de in tabel 1gegeven concentraties. Breng in een steriele kap 5 mL LB medium over in een steriele glazen reageerbuis van 15 mL met een kunststof ademende dop. Bereid een kleine cultuur buis voor elke gewenste grote (1 L) cultuur. Selecteer individuele E. coli kolonies van de LB agar plaat met behulp van een pipetpunt. Inoculeren elke buis van LB met een E. coli kolonie door het uitwerpen van een pipetpunt met een geselecteerde kolonie in elke buis. Cap elke inoculatie cultuur reageerbuis met een ademende plastic dop. Plaats de afgetopte E. coli kleine culturen in een 37 °c schud incubator voor 12 – 24 uur. Bereiding en inductie van co-expressie culturen Voeg op de volgende dag 100 mL bereide 10x fosfaatbuffer toe aan 900 mL bereide TB voor een uiteindelijke fosfaatbuffer concentratie van 1x. Voeg de nodige antibiotica toe met concentraties volgens tabel 1. Schud bij 140 rpm bij 37 °C tot warm (ongeveer 30 min). Inoculeren elke kolf van de media voor 1 L culturen met 5 mL van de inoculatie cultuur. Bewaar de pipetpunt dat wordt gebruikt voor de inoculatie cultuur in de inoculatie cultuur buis, zodat er bij de extractie met organisch oplosmiddel in de daaropvolgende stappen geen geëxtraheerde kunststof verontreinigingen zijn. Inbroed met schudden bij 200 rpm tot de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) 0,6, ongeveer 3 uur bereikt. Om de OD600 te meten met een spectrofotometer, gebruikt u een mengsel van steriele TB met fosfaatbuffer als blanco. Stel op de gewenste OD600de couveuse instellingen in op 16 °c. Bij het co-uitdrukken van P450s, vers bereiden riboflavine en aminolevulinzuur, die essentieel zijn voor voldoende P450 co-factor productie. Voor elk experiment, maken 4 g/L riboflavine en 150 g/L Aminolevulinic acid zuur. Houd de oplossing verpakt in folie tot gebruik, als riboflavine is lichtgevoelig. Nadat de incubator 16 °C (ongeveer 30 min) heeft bereikt, voeg 1 mL van 1 M IPTG, 1 mL van 4 g/L riboflavine en 1 mL 150 g/L aminolevulinzuur toe aan elke cultuur. Voor de productie van diterpenoid dient 25 mL natrium pyruvaat van 1 M aan elke kweek te worden toegevoegd om voldoende precursor vorming te verzekeren.Opmerking: alle constructies die in deze test werden gebruikt, waren onder dezelfde IPTG-inducible promotor. Verschillende promotors kunnen naar wens worden gebruikt. Inincuberen bij 16 °C en 140 rpm voor 72 h. Voeg elke volgende dag na inductie 25 mL natrium pyruvaat toe bij de productie van diterpenoïden. Onmiddellijk gebruik van culturen worden onmiddellijk gebruikt voor separatoire trechter extractie van metabolieten; oogst of bewaar geen culturen. 3. scheiding en zuivering van metabolieten Scheitrechter extractie van metabolietenOpmerking: het is belangrijk om alleen glaswerk-en glas pipetten te gebruiken bij het gebruik van organische oplosmiddelen ter voorkoming van contaminaties. In een rook afzuigkap zet je de scheidende trechter op een ring standaard. Plaats een afval beker onder de separatoire trechter. Giet 500 mL 50/50 (v/v) ethylacetaat/hexanes in de scheitrechter.Opmerking: het oplosmiddelmengsel moet worden aangepast op basis van de oplosbaarheid en polariteit van de beoogde metabolieten. Met water mengbare oplosmiddelen moeten worden vermeden om een geschikte fasescheiding te garanderen. Voeg 500 mL E. coli cultuur toe aan de separatoire trechter en plaats deze op de glazen stop. Schud de trechter om de cultuur te mengen met het extractieoplosmiddel, ongeveer 5 – 10x. Vaak ontgassen de trechter door de spigot te openen terwijl de trechter ondersteboven wordt gehouden en in de afzuigkap wordt gekeerd om druk vrij te maken. Herhaal de schud-en de-gasprocedure 2x. Plaats de trechter rechtop in de ring standaard en wacht tot de oplosmiddel laag (boven) is gescheiden van de waterige (kweek) laag (onder), ongeveer 1 min.Opmerking: wanneer een grote hoeveelheid bubbels wordt waargenomen in de interfase, kan toevoeging van een klein volume van 5 – 10 mL EtOH worden toegevoegd om de fasescheiding te verbeteren. Verwijder de stop. Giet de E. coli laag in een afval beker, met behoud van de oplosmiddel laag in de trechter. Herhaal de procedure met behulp van de resterende 500 mL E. coli cultuur en hetzelfde 500 ml oplosmiddel dat wordt gebruikt voor de eerste extractie. Giet het oplosmiddel met de geëxtraheerde metabolieten in een schone kolf. Vermijd besmetting met E. coli cultuur. Roterende verdampings concentratie Maak de roterende verdampings apparatuur (rotovap): Vul het waterbad en stel de temperatuur in op 25 °C. Gebruik voor hittegevoelige verbindingen een lagere temperatuur instelling of Voeg ijs toe aan het waterbad. Vul de condenserende kamer met droogijs en stel de draaisnelheid in op 60 – 80 rpm. Voeg ongeveer 700 mL geëxtraheerde metabolieten toe aan een verdampingskolf van 1 L, bevestig aan de rotovap en beneden in het waterbad. Zet de waterbad verwarmer aan en stel deze in op 25 °C. Start rotatie van de verdampings kolf, zet het vacuümsysteem aan en verhoog geleidelijk de zuigkracht om snel koken van de metaboliet oplossing in de afval kolf te voorkomen. Verdampte oplosmiddel moet beginnen met condensatie en druipend in de condensaat-opvang (afval) kolf. Wanneer slechts een paar mL van de metaboliet oplossing in de verdampende kolf blijft, stop rotaties en schakel het vacuümsysteem uit. Breng de verdampings kolf omhoog en druk de Vacuümleiding dicht. Behoud de geconcentreerde metaboliet oplossing die in de verdampende kolf blijft. Gooi het afval weg in de afval kolf. Ga door met roterende verdamping door maximaal 700 mL extra geëxtraheerde metaboliet oplossing toe te voegen aan de verdampings kolf. Herhaal proces totdat alle geëxtraheerde metaboliet oplossing is geconcentreerd. Verwijder de geconcentreerde metabolieten uit de verdampende kolf door deze met een glazen pipet over te brengen naar een nieuwe reageerbuis. Spoel de verdampingskolf af met 5 mL 50/50 (v/v) ethylacetaat/hexanes of het gewenste oplosmiddelmengsel tweemaal, waarbij de spoeloplossing wordt overgebracht naar de reageerbuis. Bewaar geconcentreerde metabolieten bij-20 °C of-80 °C (afhankelijk van de productstabiliteit) tot verder gebruik. Silica kolom zuivering Maak glaswerk door het spoelen van een bekerglas van 1 L, glazen trechter, 50 mL reageerbuisjes en 3,2 L chromatografie kolom (uitgerust met een glazen fret) eenmaal met hexaan en eenmaal met ethylacetaat. Label de 50 mL reageerbuisjes, die gebruikt zullen worden om fracties te verzamelen. Voeg 2 L silicagel (230 – 400 mesh, Grade 60) toe aan een 3,2 L chromatografie kolom met een reservoir capaciteit van 2 L en een gefriteerde schijf, en laad vervolgens zand om een 5 cm laag boven aan de kolom te vormen. Bereid de kolom voor chromatografie door deze grondig te spoelen met 2 L hexaan. Er moet te allen tijde een dunne laag (~ 0,5 cm) van de oplosmiddel vloeistof boven de zandlaag van de kolom staan om ervoor te zorgen dat de kolom niet uitdroogt of luchtzakken verkrijgt. Een glazen inlaat adapter die is aangesloten op een luchtslang kan worden gebruikt om de stroomsnelheid door de kolom te verhogen in plaats van alleen de zwaartekracht. Het geconcentreerde metaboliet extract (zie punt 3,2) op de kolom laden. Spoel de fles met het monster 3x met hexaan en voeg toe aan de kolom om ervoor te zorgen dat al het monster is overgebracht. Gebruik het volgende verloop, laad 100 mL per keer en Verzamel 50 mL fracties in gelabelde reageerbuisjes: 100% hexanes 3x, 10% (v/v) ethylacetaat in hexanes 3x, 12,5% (v/v) ethylacetaat in hexanes 3x, 15% (v/v) ethylacetaat in hexanes 3x , 20% (v/v) ethylacetaat in hexanes 3x, 40% (v/v) ethylacetaat in hexanes 3x, 60% (v/v) ethylacetaat in hexanes 3x, en 100% ethylacetaat 4x.Opmerking: gradiënt moet worden aangepast op basis van samengestelde grootte en polariteiten en gewenste scheiding. Gebruik een glazen pipet en breng 1 mL van elke fractie over in een injectieflacon met gelabelde GC. Analyseer elk monster via GC-MS om te bepalen welke fracties de gewenste metabolieten en hun zuiverheidsgraad bevatten.Opmerking: de GC-MS-methode die geschikt is voor de in deze methode geproduceerde metabolieten is beschreven in Mafu et al. 201839. In het kort werden alle analyses uitgevoerd op een GC met een XL MS detector met behulp van een HP-5MS kolom (Zie tabel van de materialen), een monstervolume van 1 μL, en oventemperatuur helling van 50 °c tot 300 °c bij 20 °c min-1. Nadat u hebt vastgesteld welke fracties de samengestelde (s) van belang bevatten, combineert u alle breuken die dezelfde verbinding bevatten. Verwijder fracties die geen stoffen bevatten, op de juiste wijze in een afvalbak. Herhaal de rotatie verdampings procedure indien nodig om de gezuiverde metabolieten te concentreren. Als extra zuivering nodig is, gebruik (semi-) preparatieve HPLC om de zuiverheid van het product te verbeteren. De HPLC-protocollen moeten worden aangepast op basis van individuele apparatuurspecificaties en verbindingen van belang. Respendeer gedroogde silica chromatografie monsters in 1 mL hexaan (diterpene koolwaterstoffen) of acetonitril (zuurstofhoudende diterpenoïden) en filtreer door een filter spuit om besmetting met kleine deeltjes te voorkomen. Gebruik voor niet-polaire diterpenoïden een CN-kolom (Zie tabel met materialen) met een aanbevolen debiet van 1 ml/min en een hexaan: ethylacetaat gradiënt, met fracties die elke 1 minuut worden verzameld. Gebruik voor Polar diterpenoids een C18-kolom (Zie tabel met materialen) met een aanbevolen debiet van 3 ml/min en een acetonitril: water gradiënt, met fracties die elke 1 minuut worden verzameld. Droog alle HPLC-gezuiverde fracties onder een stikstofstroom en hervat in 1 mL hexaan vóór analyse van GC-MS om de overvloed en zuiverheid van het product te beoordelen. 4. productie van diterpenoid metabolieten met behulp van N. benthamiana Opmerking: het hier beschreven protocol voor de productie van diterpenoid metabolieten in N. benthamiana is aangepast uit eerder gerapporteerde studies35,36,40,41. Het onderstaande protocol is specifiek voor injectiespuit-infiltratie van N. benthamiana bladeren. Andere infiltratie methoden, zoals vacuüm infiltratie, zijn even geschikt. Binaire T-DNA vector systemen, zoals pCAMBIA130035Su (pLIFE33) of peaq-HT40,41,42, die het mogelijk maken propagatie in E. coli en A. tumefaciens en genexpressie in plantaardige hosts zijn geschikt voor dit protocol. Aanplant Nicotiana benthamiana Vul 1 750 mL pot met potgrond en geef water aan de pot. Voeg ~ 20 tabak zaad toe en tik zachtjes met de vinger zodat ze in de bodem zijn. Niet bedekken met grond.Opmerking: zaden kunnen worden gegenereerd door zelfbestuiving voor zaad vermeerdering. Zaden voor dit experiment werden verkregen van de UC Davis Department of plant biologie, en zijn publiekelijk beschikbaar via USDA plasma repository (https://npgsweb.Ars-Grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450). Laat de pot in een groei kamer met de volgende voorwaarden, giet om de andere dag om ervoor te zorgen dat de grond niet uitdroogt. Kweek planten bij 26 °C en 60% vochtigheid met 16:8 h dag: nacht cyclus voor alle stappen in dit protocol. Na 1 week vult u ~ 20 potten met potgrond en water de potten. Met behulp van een tang, pak een zaailing van de tabak door de steel en verwijder voorzichtig uit de bron pot, het plaatsen van een zaailing in elke nieuwe pot en het zorgvuldig begraven van de wortels. De bladeren of wortels niet beschadigen. Geef de planten om de dag water door water in de bak te plaatsen waar de potten zich bevinden (ook wel “bodem water” genoemd). Elke vierde drenken, omvatten generieke meststof in het water volgens de instructies van het pakket. Freeze-ontdooien transformatie van Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 bevoegde cellen Thaw Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 (of andere voorkeurs stam) competente cellen op het ijs (~ 1 uur). Pre-chill 0,2 mL micro centrifugebuizen op ijs. Warme SOC-media bij 28 °C. Meng cellen voorzichtig met de pipetpunt (niet op en neer Pipetteer) en aliquot 15 μL cellen voor elke transformatie in de gekoelde 1,5 mL microbuisjes. Voeg 1-5 μL (~ 400 ng) DNA toe aan elke buis van competente cellen en meng zachtjes door het schrapen van een buisrek.Opmerking: de gewenste constructies hoeven geen verschillende antibiotica-resistenties te hebben omdat ze elk afzonderlijk worden getransformeerd en vóór infiltratie zullen worden gemengd. Plaats microbuisjes in vloeibare stikstof gedurende 5 min. Verwijder microtubes uit vloeibare stikstof en plaats de buizen op de kamer-temp rack. Ontdooien voor 5 min in een incubator van 37 °C. Voeg aan elke micro buis 250 μL van de vooraf opgewarmde (28 °C) SOC toe. Schud bij 28 – 30 °C, 225 rpm, voor 3 uur. Plaat 50 μL van getransformeerde cellen op LB agar platen die de in tabel 1 beschreven noodzakelijke antibiotica met behulp van steriele glas parels bevatten, zoals beschreven in stap 2.1.8. Inbroed platen geïnverteerd bij 28 – 30 °C voor 48 h. groei binnen de 1St dag van incubatie kan een teken van besmetting zijn. Getransformeerd A. tumifaciens kan worden gebruikt na de 2-daagse incubatie of bewaard bij 4 °c, verzegeld in paraffine folie gedurende maximaal 2 weken. Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande enzym co-expressie in Nicotiana benthamiana Snoeien 4-week-oude Nicotiana benthamiana planten 2 dagen vóór infiltratie door het verwijderen van lagere bladeren. Laat 4 bovenste bladeren. Water de planten. Geef de planten niet 24 uur vóór infiltratie water om open huidmondjes en eenvoudigere infiltratie mogelijk te maken. Voeg 10 mL LB toe met werk concentraties van de geschikte antibiotica voor gekozen constructies en Agrobacterium stam (beschreven in tabel 1) naar een steriele glazen reageerbuis van 50 ml met een folie deksel. Inoculeren met behulp van een pipetpunt om een enkele kolonie getransformeerde Agrobacterium te staafje en de punt in de LB-media uit te werpen. Elke Agrobacterium transformant moet ten minste 2 kleine culturen hebben. Incuberen ‘s nachts bij 28 °C en 220 TPM. Meet de extinctie op 600 nm (OD600) van de nachtelijke culturen met behulp van een spectrofotometer. Verdun de nachtelijke culturen tot een OD600 van 1.Opmerking: optimale OD600 waarden kunnen variëren bij het gebruik van andere Agrobacterium stammen. Verdeel 10 mL van de verdunde overnachtings cultuur in 50 mL conische buizen. Oogst de bacteriën door centrifugeren bij 3500 RPM gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Giet af en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de culturen in 10 mL infiltratie buffer door de buis zachtjes te schudden en op een buisrek te rollen. De OD600 moet gelijk zijn aan 1 voor elke constructie. Genereer de gewenste combinaties voor infiltraties door gelijke volumes van elke getransformeerde cellijn te combineren. De OD600 moet gelijk zijn aan 1 voor elke infiltratie. Bereken 5 mL infiltratie oplossing per blad, 2 bladeren per plant. Bevestig de buizen horizontaal aan een rocker en steen zachtjes gedurende 2 uur op kamertemperatuur. Infiltreren ~ 2 bladeren per N. benthamiana plant met ongeveer 5 ml infiltratie mengsel per blad. Infiltreer gezonde bladeren met een nageloze spuit aan de onderzijde van de bladeren terwijl u een tegen druk uitoefent met een vinger aan de bovenzijde van het blad om ervoor te zorgen dat de onfiltratie oplossing het blad weefsel verstist. Markeer alle geïnfiltreerde bladeren met een zwarte marker of een andere indicator. Plaats geïnfiltreerde planten in de groei kamer gedurende 5 dagen. Houd planten goed watered.Opmerking: een incubatietijd van vijf dagen is voldoende gebleken voor het bereiken van diterpenoid-niveaus die voldoende zijn voor de meeste downstream-analyses, met behoud van de tijd efficiëntie van de product vorming. Langere incubatie perioden kunnen worden getest, waar hogere producthoeveelheden nodig zijn. Metaboliet extractie en zuivering van getransformeerde Nicotiana benthamiana Oogst geïnfiltreerde bladeren van planten door ze uit de plant te clippen. Voeg ~ 100 mL vloeibare stikstof en een enkel blad aan een mortel, dan slijpen met behulp van een mortier en een stamper of weefsel molen tot het verkrijgen van een fijn poeder. Voeg poedervormige weefsels toe aan een GC-MS-injectieflacon met de afbakening van 500 μL. Voeg 1,5 mL 50/50 (v/v) ethylacetaat/hexaan of gewenst oplosmiddelmengsel toe aan de injectieflacon en dop stevig. Voor uitdrukkingen die zijn getest om de gewenste producten te leveren, zwembad grondweefsel in een grotere kolf of reageerbuis, voeg dan ~ 2x de hoeveelheid oplosmiddel dan weefsel volume en schud ‘s nachts. Ga verder naar stap 4.4.5 voor zuivering. Plaats alle flacons in een microtube rack en plak deze stevig vast om te beveiligen. Extract onder krachtig schudden ‘s nachts bij kamertemperatuur. Breng 400 μL extract en 600 μL hexaan over in een nieuwe injectieflacon met GC-MS. Geen blad weefsel aliquot. Analyseer samples met behulp van GC-MS met behulp van de methode beschreven in stap 3.3.6.1. Na analyse via GC-MS voor de aanwezigheid van de gewenste metabolieten, pool blad extracten samen en ga door roterende verdamping, silica Kolomchromatografie, en HPLC om zuivere verbindingen te verkrijgen zoals beschreven in de punten 3,2 en 3,3.

Representative Results

Schematische workflow voor diterpenoid productie met behulp van E. coliFiguur 1 illustreert de beschreven workflow voor de productie van diterpenoid. Het hier beschreven protocol is aangepast van een eerder beschreven E. coli -platform voor diterpenoid biosynthese13,32 voor het gebruik van grotere culturen en zuivering van de gewenste diterpenoid producten via silica Chromatografie. Om het gebruik van dit protocol aan te tonen, gebruikten we een recent geïdentificeerde dolabralexin traject van maïs dat bestaat uit twee diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) en ZmKSL4 (Zm00001d032858), een multi-functioneel P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134), en een cytochroom P450 reductase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Figuur 2). In het kort werden E. coli BL21DE3-C41 competente cellen voorgetransformeerd met het pcdfduet: IRS en pacyc-duet: ggpps/ZmAN2 plasmiden13,32. Het pCDFDuet: IRS plasmide bevat belangrijke enzymen voor de productie van de voorloper van diterpenoid, waaronder 1-deoxy-D-xylulose-5-fosfaat synthase (DXS), 1-deoxy-d-xylulose-5-fosfaat reductase (DXR), en isopentenylpyrofosfaat difosfaat isomerase (Idi), en bleek te verhogen diterpenoid vorming in E. coli13. Het pACYC-duet: GGPPS/ZmAN2 plasmide bevat de maïs ent-copalyl difosfaat synthase ZmAN2 en een ggpp synthase van Abies grandis. Enzymen die de betrokken reacties katalyseren in de biosynthese van dolabralexin werden vervolgens samen getransformeerd als plasmiden pET28b: ZmKSL4 en pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. Voor details over sequenties en plasmide constructies Zie Mafu et al. 201839. Een GC-MS chromatogram van de geëxtraheerde enzym producten wordt getoond in Figuur 3a, ter illustratie van de vorming van drie dolabralexin verbindingen, namelijk dolabradiene (1,2 ± 0,25 mg/l cultuur), epoxydolabrene (0,65 ± 0,2 mg/l cultuur), en epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L cultuur), zoals gekwantificeerd op basis van een standaard curve met behulp van de diterpenoid Sclareol. Sclareol werd gebruikt als een referentie-standaard, als gevolg van de soortgelijke structuur en chemische eigenschappen in vergelijking met dolabralexins. Typisch waargenomen kleine bijproducten omvatten chlooramfenicol, de indoolderivaten oxindole en indool-5-aldehyde, en de precursor geranylgeranyl difosfaat (GGPP) (Figuur 3). Indool vertegenwoordigt meestal het primaire bijproduct, maar wordt hier niet weergegeven, vanwege de retentietijd korter dan de ingestelde oplosmiddel vertraging van 7 min om de integriteit van het GC-MS-instrument te behouden. Schematische workflow van diterpenoid productie met behulp van N. benthamianaFiguur 4 toont een overzicht van de uitdrukking van het dolabralexin traject in N. benthamiana. Voor de hier beschreven producten werden de volgende constructies afzonderlijk omgezet in een. tumefaciens stam GV3101: pLife33: P19 (uitdrukken van het P19 gen uitschakeling eiwit), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Volledige lengte inheemse sequenties van de maïs dolabralexin pathway genen werden gebruikt in de binaire T-DNA vector pLife3341 met kanamycine resistentie voor vermeerdering in E. coli en A. tumefaciens. Co-expressie van upstream terpeen pathway genen is facultatief, aangezien de precursor geranylgeranyl difosfaat endogeen is gevormd in N. benthamiana. Echter, verschillende studies hebben met succes gebruikt dergelijke benaderingen te verhogen diterpenoid vorming in N. benthamiana14,36,41. Zoals geïllustreerd in Figuur 3, produceerde co-expressie met succes dolabradiene en 15, 16-epoxydolabrene. In tegenstelling tot enzym co-expressie in E. coli, is 15, 16-epoxydolabranol niet gedetecteerd in extracten van de metaboliet. Aanwezigheid van 15, 16-epoxydolabrene in blad extracten demonstreerde de activiteit van CYP71Z18 in N. benthamiana. Aangezien 15, 16-epoxydolabranol bleek stabiel te zijn na extractie uit microbiële culturen (Figuur 3) en na isolatie van maïs wortel weefsels in eerdere studies39, lijkt het aannemelijk dat het gehydroxyleerde product geglycosyleerd is door endogene glycosyltransferasen en vervolgens in de vacuole, waardoor het ontoegankelijk is voor extractie met de organische oplosmiddel mengsels die hier worden gebruikt voor extractie36,43,44,45 ,46. Soortgelijke ongewenste product modificaties in het kader van pathway Engineering in N. benthamiana zijn gemeld in voorgaande studies47. Zoals weergegeven voor co-expressie in E. coli, voorbijgaande expressie in N. benthamiana resulteert in de extractie van verschillende bijproducten, met inbegrip van lineaire alkanen van verschillende ketenlengte als gebaseerd op vergelijking met referentiemassa Spectra databases. Samengestelde Antilichaamtiters geëxtraheerd uit blad materiaal bleken gemiddeld 2,4 +/-0,5 mg dolabradiene en 0,9 +/-0,3 mg 15, 16-epoxydolabrene per g droog blad weefsel. Deze Antilichaamtiters kunnen niet rechtstreeks worden vergeleken met het E. coli co-expressie systeem gezien de verschillende experimentele set-ups. Diterpenoid zuiveringDiterpenoid zuivering werd bereikt met behulp van silica Kolomchromatografie en daaropvolgende semi-preparatieve HPLC. Metaboliet extracten van 12 L gepoolde E. coli culturen werden gezuiverd met behulp van silica Kolomchromatografie om de drie focal dolabralexin verbindingen te scheiden (Figuur 3a). Silica chromatografie is ideaal voor het bereiken van hoge zuiverheid van de doelverbindingen, omdat het eenvoudige scheiding van diterpeen olefinen en zuurstof derivaten mogelijk maakt, en gemakkelijk verwijdert de grote verontreiniging, oxindole, die wordt vastgehouden op de silica matrix ( Figuur 3a). Figuur 1: workflow voor diterpenoid productie in E. coli en metaboliet zuivering uit vloeibare bacteriële culturen. Onderbroken dozen geven optionele stappen weer waar extra zuivering nodig is. A) representatiefbeeld van de geëxtraheerde E. coli cultuur met behulp van een separatoire trechter. B) representatief beeld van de zuivering van de metaboliet extract met behulp van silica chromatografie.   Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Dolabralexin biosynthetische pathway en genconstructies gebruikt in deze studie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: GC-MS-resultaten. Weergegeven zijn representatieve GC-MS-chromatogrammen van gezuiverde diterpenoid producten verkregen met behulp van enzym-co-expressie-assays in (a) E. coli en (B) N. benthamiana. Product identificaties zijn gebaseerd op vergelijkingen met authentieke normen en referentiemassa spectra van de National Institute of Standards and Technology (NIST) Mass spectrale bibliotheek. 1, oxindole; 2, indool-5-aldehyde; 3, pyrrolo [1,2-a] Pyrazine-1, 4-dione, hexahydro-3-(2-methylpropyl)-; 4, 6-O-acetyl-1-[[4-bromophenyl] thio]-a-d-glucoside S, S-dioxide; 5, dolabradiene; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, pyrrolo [1,2-a] Pyrazine-1, 4-dione, hexahydro-3-(fenylmethyl)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 en 12, onbekend; 10, chlooramfenicol; 11, 3, 7, 11, 15-tetramethyl-2-hexadecen-1-OL; 13-16, alkanen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: Diterpenoid productie in N. benthamiana. (A) workflow van diterpenoid productie in N. benthamiana en metaboliet zuivering van blad materiaal. B) representatief beeld van n. benthamiana -planten, klaar voor infiltratie-experimenten, alvorens te snoeien. C) representatieve beelden van N. benthamiana -planten na snoeien. D) beeld van door de spuit geïnfiltreerde bladeren. Er zijn donkere gebieden geïnfiltreerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Breder onderzoek en toepassing van diterpenoid natuurlijke producten vereist eenvoudige, goedkope protocollen voor het synthetiseren en zuiveren van voldoende hoeveelheden van de gewenste verbindingen. De snelle toename van het aantal beschikbare diterpenoid-metabole enzymen uit een breed scala van soorten biedt nu een expansieve inventaris voor de enzymatische productie van diterpenoïden met behulp van microbiële en plantaardige hostsystemen. Daarnaast maakt de modulaire architectuur van veel diterpenoid trajecten het gebruik van enzymen van dezelfde of verschillende soorten in ‘ Plug & Play ‘ combinatorische technische benaderingen voor het genereren van een scala aan natuurlijke en nieuwe natuur-achtige diterpenoid natuurlijke producten2,14,26,35.

E. coli is een geprefereerde microbiële gastheer voor biosynthese van natuurlijke producten vanwege de robuustheid, het gemak van schaalbaarheid, beperkte chemische complexiteit voor verminderde bijproducten van het product en de rijkdom aan beschikbare hulpmiddelen voor DNA-assemblage en-expressie Optimalisatie. In onze ervaring is het hier beschreven platform zeer geschikt voor het produceren van product opbrengsten van maximaal enkele honderden mg diterpeen Olefins Polymers en alcoholen, wat geschikt is voor veel downstreamtoepassingen, waaronder die welke hier worden voorgesteld. Hoewel het niet voldoen aan industriële schaal, het productieplatform hier beschreven kan dienen als een basis voor verdere traject, gastheer, en fermentatie-optimalisatie zoals is met succes aangetoond voor gerelateerde diterpenoids zoals taxadiene en Sclareol33 ,34. Overmatige expressie van snelheids begrenzende MVA-of MEP-trajecten-genen is met succes vastgesteld om rendements beperkende factoren voor diterpenoid biosynthese te overwinnen, zoals een ontoereikende precursor-en precursor stroom in concurrerende trajecten13, 32,33,39. Hoewel bewezen succesvol in verschillende studies, slechte expressie en katalytische activiteit van Terpenoid-metabole eukaryotische P450s en andere membraan-gebonden enzymen in E. coli is een waarschijnlijke beperkende factor33,39 ,48,49,50,51,52. Gebruik van codon-geoptimaliseerde sequenties en eiwit modificaties, zoals het verwijderen van het endoplasmisch reticulum-signaal peptide of de introductie van een plastidial-signaal peptide, is nuttig gebleken om de oplosbare P450-expressie te verhogen14,38 ,49,50,53. Dergelijke wijzigingen werden ook toegepast voor de microbiële co-expressie van maïs CYP71Z1839 gebruikt als een voorbeeld traject in deze studie. De beschreven protocollen zijn gebaseerd op het gebruik van plasmiden die één of twee genen per constructie dragen, allemaal onder dezelfde, niet-induceerbaar promotor. Waar grotere gencombinaties gewenst zijn, is het raadzaam om verschillende beschikbare multi-Gene cassettes of genstacking systemen te gebruiken om de verminderde transformatie-efficiëntie en cultuur groei te verminderen door het gebruik van meerdere plasmiden en antibiotica13 .

Met de bredere beschikbaarheid van genetica en genomics middelen, worden plant host systemen ook steeds meer geschikt voor de vervaardiging van natuurlijke producten. Voordelen zijn onder andere het vermogen van planten om de vereiste natuurlijke precursoren te produceren die worden aangedreven door fotosynthese, waardoor product vorming mogelijk is zonder de noodzaak om precursor moleculen54,55aan te vullen. N. benthamiana wordt al veel gebruikt voor in vivo functionele karakterisering en combinatorische expressie van terpeen en andere natuurlijke product trajecten14,35,36,40 . Opmerkelijke voordelen van het gebruik van N. benthamiana als een gastheer systeem omvatten de endogene productie van diterpenoid precursoren, gebruik van inheemse genen sequenties, vereenvoudigde expressie van eukaryotische P450s, gemak van combinatorische gentransformatie (als afzonderlijke antibiotica zijn niet vereist voor voorbijgaande co-transformatie), en eenvoudige extractie van doel producten uit blad materiaal. Waar nodig kan de productie van diterpenoid worden verbeterd door middel van co-expressie van belangrijke MEP-traject genen om de precursor-aanvoer te verhogen36,41. Beperkingen voor schaalbare diterpenoid productie in N. benthamiana zijn complexer in vergelijking met vloeibare microbiële culturen als gevolg van de noodzaak voor het genereren van voldoende plant biomassa, meer arbeidsintensieve product zuivering van chemisch complexe plantenweefsel, en mogelijke ongewenste metabolization van doel producten door, bijvoorbeeld, oxidatie, glycosylatie of defosforylering door endogene enzymen36,43,44,45 ,46,47. Echter, deze procedure kan worden opgeschaald tot mg producthoeveelheden door het verhogen van het aantal planten gebruikt voor agroinfiltratie56.

De hier beschreven product extractie-en zuiverings protocollen zijn compatibel met E. coli en N. benthamiana, evenals S. cerevisiae en andere plantaardige of microbiële hostsystemen, en bieden een kostenefficiënte aanpak die gemakkelijk te opgezet in zowel biologie-als chemie laboratoria en vereist geen dure zuiverings apparatuur. De extractie van metabolieten met behulp van een scheitrechter is zeer geschikt voor efficiënte extractie en fasescheiding voorafgaand aan chromatografische zuivering. Trechter grootten kunnen gemakkelijk worden aangepast om grotere cultuur volumes mogelijk te maken en de experimentele tijd die nodig is om te extraheren uit grote culturen te verminderen. We vonden het gebruik van een hexaan/ethylacetaat gradiënt ideaal voor het extraheren van diterpenoïden van verschillende polariteit, zoals hier gedemonstreerd voor de groep van dolabralexinen die zowel koolwaterstof en zuurstofrijk verbindingen omvatten (Figuur 3). Afhankelijk van de eigenschappen van doel producten kunnen andere oplosmiddel mengsels voordelig zijn. Oplosmiddelen mogen echter niet mengbaar zijn met water om een succesvolle extractie en fasescheiding te garanderen met behulp van de separatory trechter techniek. Daarnaast moet rekening worden gehouden met productverlies door verdamping bij het gebruik van deze aanpak voor de productie van vluchtige organische stoffen (VOS), zoals mono-en SESQUI-terpenoïden met een lager molecuulgewicht en andere Vos. Chromatografische scheiding van diterpenoïden van verschillende niveaus van oxygenatie met behulp van een grotere schaal (~ 2 L) silica kolom is voordelig in onze ervaring, omdat het zorgt voor een verbeterde product scheiding en minimaliseert de noodzaak voor iteratieve zuivering stappen bij het gebruik van kleinere kolom volumes. Kolom volumes en matrices kunnen zo nodig worden aangepast voor het gewenste kweek volume en het type natuurproduct. De zuiverheid van doel producten die met dit protocol kan worden bereikt, is geschikt voor veel downstreamtoepassingen, zoals bioactiviteitentesten of voor gebruik in enzym activiteitsanalyses. Wanneer echter hogere zuiverheidsniveaus nodig zijn, zoals structurele analyses via NMR, kan de zuiverheid van het product efficiënt worden versterkt door extra zuivering met (semi)-preparatieve HPLC.

Dit protocol beschreven hier is geoptimaliseerd voor de productie van diterpenoid natuurlijke producten, maar kan ook gemakkelijk worden aangepast aan verwante mono-, SESQUI-en Tri-terpenoïden, evenals andere natuurlijke productklassen gewoon door het genereren van het gewenste enzym modules voor combinatorische expressie14,57. Er moet echter rekening worden gehouden met wijzigingen in de procedures voor product extractie en-zuivering voor verbindingen met een hogere volatiliteit, zoals mono-en SESQUI-terpenoïden, of hogere polariteit en functionele modificatie zoals geïllustreerd door glycosylatie van vele triterpenoïden, fenylpropanoïden, en andere natuurlijke productklassen.

Hoewel industriële platforms voor de vervaardiging van natuurlijke producten beschikbaar zijn, bieden de hier beschreven protocollen een goedkoop, aanpasbaar hulpmiddel dat in de meeste laboratoria gemakkelijk kan worden opgezet. Zoals blijkt uit de productie van maïs dolabralexinen hier en elders39, zijn de producthoeveelheden en zuiverheid die met deze benadering kunnen worden bereikt, doorgaans voldoende om verschillende downstreamanalyses en toepassingen te faciliteren, waaronder, maar niet beperkt tot, verschillende bioactiviteitsonderzoeken, analyse van interacties tussen organismen, evenals voor gebruik als enzym substraten of als uitgangsmateriaal voor semi-synthese benaderingen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij erkennen Dr. Reuben Peters (Iowa State University, VS) voor het verstrekken van de pIRS en pGGxZmAN2 constructies. Financiële steun voor dit werk door de NSF plant-Biotic interactions programma (Grant # 1758976 tot P.Z.), het DOE Early Career research programma (Grant # DE-SC0019178 to P.Z.), het DOE joint Genoome Institute Community Science Program (Grant # CSP2568 to P.Z.), de NSF Graduate Research Fellowship Program (to K.M.M.) en een UC Davis dean’s Mentorship Award Fellowship (to K.M.M.) worden dankbaar erkend.

Materials

1020 Trays Greenhouse Megastore CN-FLHD
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Sigma M8250-500g MES
4" Tech Square Pot McConkey Wholesale Grower's Supply JMCTS4
5977 Extractor XL MS Agilent –
7890B GC Agilent –
Acetonitrile Sigma 271004
Agar Fisher BP1423-2
Bacterial yeast extract Fisher BP9727-2
Beaker CTechGlass BK-2001-015B
Cap, 9 mm blue screw, PFTE Agilent 5185-5820 GC vial cap
Carbenicillin Genesee 25-532 Carb
Chloramphenicol Fisher 50247423 Chlor
Chromatography column CTechGlass CL-0015-022
Clear humidity dome Greenhouse Megastore CN-DOME
ColiRollers Plating Beads Sigma 71013 Glass beads
CoorsTek Porcelain Mortars Fisher 12-961A mortar
CoorsTek Porcelain Pestles Fisher 12-961-5A pestle
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride Sigma 50981039 Aminoleuvolinic acid
Ethanol Fisher A962-4 EtOH
Ethyl acetate Fisher E1454
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher 14-432-22 Falcon tubes
Fisherbrand Disposable Cuvettes Fisher 14-955-127 cuvette
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 petri dish
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks Fisher 05-541 microtube rack
Glucose Sigma G7021
Glycerol Fisher G33-500
Hexanes Fisher H292-4 (CS)
HP-5MS Agilent 19091S-433 GC column
Inlet adapter CTechGlass AD-0006-003 glass inlet adapter
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Fisher BP1755-100 IPTG
Kanamycin Fisher BP9065 Kan
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase VWR 60825-798 breathable test tube lids
Magnesium chloride Acros 223210010 MgCl2
Magnesium sulfate Sigma M7506-500g MgSO4
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2756810
Mixer Mill MM 200 Retsch 20.746.0001 tissue mill
Nalgene Fernbach culture flask Sigma Z360236 2.8 L flask
New Brunswick I26 Eppendorf M1324-0000 Shaking incubator
Nicotiana benthamiana seed USDA Germplasm Repository Accession TW16 N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells Lucigen 60442 C41-DE3 cells
Parafilm M wrapping film Fisher S37440 Parafilm
Potassium chloride Sigma P-9541 KCl
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher P288-3 Dipotassium phosphate
Potassium phosphate monobasic Monopotassium phosphate
Pyrex disposable culture tubes, rimless Sigma CLS9944516 test tubes
Pyruvate Acid Sodium Salt Fisher 501368477 Sodium pyruvate
Retort Ring Stands CTechGlass ST00 ring stand
Riboflavin Amresco 0744-250g
Rifampicin Sigma R7382 Rif
Rotovap
Sand, 50-70 mesh particle size Sigma 274739-1KG
Silica Fisher AC241660010 silica gel
Sodium chloride Fisher 5271-3 NaCl
Sodum hydroxide Fisher SS266-1 NaOH
Spectinomycin Fisher 501368607 Spec
Squibb Separatory Funnel CTechGlass FN-1060-006 Separatory funnel
Sunshine Mix #1 Sungro Horticulture Potting soil
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher 21-402-902 microtube
Triangle funnel CTechGlass FN-0035 funnel
Tryptone Fisher BP14212
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn Agilent 5182-0716 GC vial
visible spectrophotometer, V-1200 VWR 634-6000P spectrophotometer
ZORBAX Eclipse XDB-C18 Agilent 990967-202 HPLC column
ZORBAX Eclipse XDB-CN Agilent 990967-905 HPLC column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128 (2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006 (2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426 (2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001 (2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46 (2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290 (2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. a. n. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255 (2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114 (2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24 (2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647 (2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Tags

DiterpenoidNatural ProductMetaboliteEnzymatic ProductionPurificationCustomizable ApproachE. ColiCompetent CellsTransformationColony SelectionSmall CultureTerrific BrothPurification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Murphy, K. M., Chung, S., Fogla, S., Minsky, H. B., Zhu, K. Y., Zerbe, P. A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products. J. Vis. Exp. (152), e59992, doi:10.3791/59992 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image