Summary

Tau Subsellojen Lokalizasyonunun Hastalıkla İlgili Genlerin İfadesini Araştırmaaracı Olarak Modülasyonu

Published: December 20, 2019
doi:

Summary

Tau, hem mikrotübülleri bağladığı sitoplazmada hem de Alzheimer hastalığına bağlı genlerin modülasyonu da dahil olmak üzere alışılmadık işlevler uyguladığı çekirdekte bulunan nöronal bir proteindir. Burada, sitoplazmik Tau gelen herhangi bir girişim hariç nükleer Tau işlevini araştırmak için bir yöntem açıklar.

Abstract

Tau nöronlarda ifade edilen bir mikrotübül bağlayıcı proteindir ve bilinen ana işlevi sitoskeletal stabilitenin sürdürülmesi ile ilgilidir. Ancak, son kanıtlar Tau’nun DNA koruması, rRNA transkripsiyonunda, retrotranspozonların hareketliliğinde ve nükleolus. Yakın zamanda nükleer Tau’nun VGluT1 geninin ekspresyonunda yer aldığını gösterdik, Alzheimer hastalığının erken evrelerinde glutamat salınımının patolojik artışını açıklayabilecek moleküler bir mekanizma öneriyoruz. Yakın zamana kadar, nükleer Tau’nun hedef genlerin ekspresyonunu modüle etmedeki rolü, sitoplazmik Tau’nun katkısının dışlanmasını veya diğer genlerin etkisini engelleyen teknik sınırlamalar nedeniyle nispeten belirsiz ve belirsiz olmuştur. nükleer Tau ile ilgili olmayan aşağı faktörler. Bu belirsizliğin üstesinden gelmek için, özellikle nükleer Tau proteini tarafından modüle edilen hedef genlerin ekspresyonunu incelemek için bir yöntem geliştirdik. Yerelleştirme sinyallerinive hücre altı fraksiyonlarını çiftlerin sitoplazmik Tau moleküllerinden parazitin dışlanmasını sağlayan bir protokol uyguladık. En önemlisi, protokol kolaydır ve diğer hücre tipleri ve hücresel koşullarda Tau’nun nükleer işlevini incelemek için geniş uygulanabilir klasik ve güvenilir yöntemlerden oluşur.

Introduction

Çekirdekteki Tau proteininin işlevleri son yıllarda önemli bir ilgi kazanmıştır, çünkü nükleik asitler1,2,3,4,5,6ile yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir. Nitekim, yeni bir genom çapında çalışma Tau in vivo7jenik ve interjenik DNA dizileri bağlar gösterdi . Nükleolar organizasyonda bir rol8,9,10,11önerilmiştir. Ayrıca, Tau oksidatif ve hipertermik stres e karşı DNA koruması dahil olmak için önerilmiştir5,10,12,13, mutasyona uğramış Tau kromozom istikrarsızlığı ve aneuploidy14bağlantılı ise,15,16.

Şimdiye kadar, nükleer bölmede Tau’nun işlevlerini incelemedeki zorluklar, nükleer Tau’nun sitoplazmik Tau’nun katkısının incelenmesindeki güçlükler nedeniyle neredeyse çözülemedi. Dahası, nükleer bölmedeki Tau moleküllerine atfedilen fonksiyonlar, şimdiye kadar, sadece nükleer Tau proteinlerinin doğrudan tutulumu na dair açık bir gösteri den yoksun oldukları için ilişkilidir. Gerçekten de, retrotranspozons veya rRNA transkripsiyon veya DNA koruması11,12,17,18,19 hareketlilik Tau katılımı da sitoplazmik Tau katkısı veya nükleer Tau ile ilgili olmayan diğer downstream faktörlerin etkisi ile açıklanabilir.

Burada, nükleer lokalizasyon (NLS) veya nükleer ihracat sinyalleri (NES) ile etiketlenmiş 0N4R yapıları ile birlikte nükleer bölmeyi izole etmek için klasik bir prosedürden yararlanarak bu sorunu çözebilecek bir yöntem salıyoruz. Bu yaklaşım, Sitoplazmik bölmeden Tau moleküllerinin dökülmesi nedeniyle olası eserlerile ilgili karmaşık sorunları ortadan kaldırır. Ayrıca, Tau-NLS ve Tau-NES yapıları, nükleer Tau moleküllerinin belirli bir fonksiyonda yer alması için olumlu ve olumsuz kontroller sağlayarak, sırasıyla, nükleer bölmeden Tau moleküllerinin zenginleşmesini veya dışlanmasını sağlar. Protokol teknik olarak kolaydır ve geniş diğer hücre tiplerinde Tau nükleer fonksiyon çalışması için geçerli olan klasik ve güvenilir yöntemlerden oluşur, farklılaşmış ya da değil, Tau ifade yeniden kanser hücreleri gibi20,21. Ayrıca, farklı bölmelerle ilgili biyolojik fonksiyonları incelemek için hem sitoplazmada hem de çekirdekte bulunan diğer proteinlere de uygulanabilir.

Protocol

1. Hücre Kültürü Kültür SH-SY5Y hücreleri (insan nöroblastom hücre hattı, CRL-2266) tam ortamda (Dulbecco modifiye Kartal orta: besin karışımı F12 [DMEM / F-12] ile birlikte 10% fetal sığır serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 μg/mL streptomyc). Hücreleri 37 °C ve %5 CO2’debir kuvözde saklar. Hücreleri 10 cm’lik tabaklarda büyütün ve konca olduğunda bölün. 2. Hücre Farklılaşması SH-SY5Y hücrelerini ayır…

Representative Results

Sitoplazmik Tau proteinlerinin katkısından kaçınarak nükleer Tau’nun gen ekspresyonundaki etkisini incelemek için kullanılan strateji Şekil 1’degösterilmiştir. Kısaca, TAU proteinleri NLS veya NES ile etiketlenmiş veya nükleer bölme dışında, sırasıyla birikir. Bu dengesizliğin fonksiyonel etkisi VGluT1 geninin ürünü olarak ölçülen gen ekspresyonunun değiştirilmesidir. Pro…

Discussion

Nükleer Tau proteininin gen ekspresyonu üzerindeki etkisini ölçmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol ile sitoplazmik Tau’nun katkısı kuvvetle sınırlıdır. Bu protokolün kritik adımları şunlardır: insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması, subsellüler fraksiyonu ve nükleer bölmede Tau proteinlokalizasyonu.

İlk olarak, temsili sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, SH-SY5Y hücrelerinin RA ve BDNF ekleyerek farklılaşması kültürde nöron benze…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH=8 0.5M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/ml, 100ml
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

References

  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically – The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer’s Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?. Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Play Video

Cite This Article
Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

View Video