Modulation de la localisation sous-cellulaire de Tau comme outil pour étudier l'expression des gènes liés à la maladie
Summary
Tau est une protéine neuronale présente à la fois dans le cytoplasme, où il lie les microtubules, et dans le noyau, où il exerce des fonctions non conventionnelles, y compris la modulation des gènes liés à la maladie d’Alzheimer. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier la fonction du Tau nucléaire tout en excluant toutes les interférences provenant du Tau cytoplasmique.
Abstract
Tau est une protéine de liaison microtubule exprimée dans les neurones et sa fonction principale connue est liée au maintien de la stabilité cytosquelettique. Cependant, des preuves récentes ont indiqué que Tau est également présent dans d’autres compartiments subcellulaires, y compris le noyau où il est impliqué dans la protection de l’ADN, dans la transcription de l’ARNr, dans la mobilité des rétrotransposons et dans l’organisation structurelle de la Nucléole. Nous avons récemment démontré que le Tau nucléaire est impliqué dans l’expression du gène VGluT1, suggérant un mécanisme moléculaire qui pourrait expliquer l’augmentation pathologique de la libération de glutamate dans les premiers stades de la maladie d’Alzheimer. Jusqu’à récemment, l’implication du nucléaire Tau dans la modulation de l’expression des gènes cibles était relativement incertaine et équivoque en raison de limitations techniques qui empêchaient l’exclusion de la contribution du Tau cytoplasmique ou l’effet d’autres facteurs en aval non liés au Tau nucléaire. Pour surmonter cette incertitude, nous avons mis au point une méthode pour étudier l’expression des gènes cibles spécifiquement modulées par la protéine tau nucléaire. Nous avons utilisé un protocole qui couple l’utilisation de signaux de localisation et la fractionnement subcellulaire, permettant l’exclusion de l’interférence des molécules cytoplasmiques Tau. Plus particulièrement, le protocole est facile et est composé de méthodes classiques et fiables qui sont largement applicables pour étudier la fonction nucléaire de Tau dans d’autres types de cellules et les conditions cellulaires.
Introduction
Les fonctions de la protéine Tau dans le noyau ont suscité un intérêt significatif ces dernières années, car il a été montré pour être étroitement associé aux acides nucléiques1,2,3,4,5,6. En effet, une étude récente à l’échelle du génome a démontré que Tau lie des séquences d’ADN géniques et intergéniques in vivo7. Un rôle dans l’organisation nucléolar a été suggéré8,9,10,11. En outre, Tau a été proposé d’être impliqué dans la protection de l’ADN contre le stress oxydatif et hyperthermique5,10,12,13, tandis que Mutated Tau a été liée à l’instabilité chromosomique et l’aneuploidy14,15,16.
Jusqu’à présent, les défis dans l’étude des fonctions de Tau dans le compartiment nucléaire sont restés presque non résolus en raison des difficultés à disséquer la contribution spécifique de Tau nucléaire de la contribution de Tau cytoplasmique. En outre, les fonctions attribuées aux molécules de Tau dans le compartiment nucléaire, jusqu’à présent, ne sont que corrélatives parce qu’elles manquent d’une démonstration sans équivoque de l’implication directe des protéines tau nucléaires. En effet, l’implication de Tau dans la mobilité des rétrotransposons ou dans la transcription de l’ARNr ou dans la protection de l’ADN11,12,17,18,19 pourrait également s’expliquer par la contribution du cytoplasmique Tau ou par l’effet d’autres facteurs en aval non liés au Tau nucléaire.
Ici, nous fournissons une méthode qui peut résoudre ce problème en exploitant une procédure classique pour isoler le compartiment nucléaire combiné avec l’utilisation de Tau construit 0N4R marqué avec la localisation nucléaire (NLS) ou des signaux d’exportation nucléaire (NES). Cette approche élimine les problèmes complexes liés aux artefacts possibles en raison du débordement des molécules de Tau du compartiment cytoplasmique. En outre, les constructions Tau-NLS et Tau-NES induisent l’enrichissement ou l’exclusion des molécules De Tau du compartiment nucléaire, respectivement, fournissant des contrôles positifs et négatifs pour l’implication des molécules nucléaires de Tau dans une fonction spécifique. Le protocole est techniquement facile et il est composé de méthodes classiques et fiables qui sont largement applicables pour étudier la fonction nucléaire de Tau dans d’autres types de cellules, différenciées ou non, telles que les cellules cancéreuses qui réactivent l’expression Tau20,21. En outre, il pourrait être appliqué également à d’autres protéines qui sont présentes dans le cytoplasme et le noyau afin de disséquer les fonctions biologiques liées à différents compartiments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons une méthode pour mesurer l’impact de la protéine Tau nucléaire sur l’expression de gène. Avec ce protocole, la contribution du tau cytoplasmique est fortement limitée. Les étapes critiques de ce protocole sont les suivantes : la différenciation des cellules sH-SY5Y du neuroblastome humain, la fractionnement subcellulaire et la localisation de la protéine Tau dans le compartiment nucléaire.
Tout d’abord, comme le montre la section des résultats représentatifs, la diff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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