تعديل التعريب تاو Subcellular كاداه للتحقيق في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمرض
Summary
تاو هو بروتين الخلايا العصبية الموجودة علي حد سواء في السيتوبلاسما ، حيث انه يربط الأنابيب الدقيقة ، وفي النواة ، حيث يمارس وظائف غير تقليديه بما في ذلك تحوير الجينات المرتبطة بمرض الزهايمر. هنا ، ونحن وصف طريقه للتحقيق في وظيفة تاو النووية في حين استبعاد اي تدخلات قادمه من السيتوبلازمي تاو.
Abstract
تاو هو بروتين ملزم ميكروتوبولي المعرب عنها في الخلايا العصبية ويرتبط وظيفتها الرئيسية المعروفة للحفاظ علي الاستقرار خلوي. ومع ذلك ، أشارت الادله الاخيره إلى ان تاو موجود أيضا في مقصورات فرعيه أخرى بما في ذلك النواة حيث انها متورطة في حماية الحمض النووي ، في النسخ rRNA ، في حركه الرجعية وفي التنظيم الهيكلي لل نويه. وقد أظهرنا مؤخرا ان تاو النووية تشارك في التعبير عن جين VGluT1 ، مما يوحي بوجود اليه الجزيئية التي يمكن ان تفسر الزيادة المرضية من الإفراج الغلوتامات في المراحل المبكرة من مرض الزهايمر. حتى وقت قريب ، كانت مشاركه تاو النووية في تحوير التعبير عن الجينات المستهدفة غير مؤكده نسبيا وغامضه بسبب القيود التقنية التي منعت استبعاد مساهمه السيتوبلازمية تاو أو تاثير الأخرى عوامل المصب غير المرتبطة بالنووية تاو. للتغلب علي هذا الشك ، قمنا بتطوير طريقه لدراسة التعبير عن الجينات المستهدفة التي يتم تضمينها علي وجه التحديد من قبل بروتين تاو النووي. استخدمنا بروتوكولا ان الأزواج استخدام إشارات التعريب وتجزئه سوبسيلولار ، مما يسمح باستبعاد التدخل من جزيئات تاو سيتوبلازمي. والاهم من ذلك ، ان البروتوكول سهل ويتالف من أساليب كلاسيكية وموثوقه يمكن تطبيقها علي نطاق واسع لدراسة الوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى والظروف الخلوية.
Introduction
وقد اكتسبت وظائف بروتين تاو في النواة اهتماما كبيرا في السنوات الاخيره ، حيث ثبت انها ترتبط ارتباطا وثيقا بالأحماض النووية1،2،3،4،5،6. وفي الواقع ، أظهرت دراسة أجريت مؤخرا علي نطاق الجينوم ان تاو تربط متواليات الحمض النووي الوراثية والجينية في الجسم الحيوي7. وقد اقترح دور في نوكليولار منظمه8و9و10و11. وعلاوة علي ذلك, وقد اقترح تاو لتكون متورطة في حماية الحمض النووي من الاكسده وفرط الضغط المفرط5,10,12,13, في حين تم ربط المتحول تاو إلى عدم استقرار الكروموسوم و صيغه الصبغيه14,15,16.
حتى الآن ، ظلت التحديات في دراسة وظائف تاو في المقصورة النووية دون حل تقريبا بسبب الصعوبات في تشريح مساهمه محدده من تاو النووية من مساهمه السيتوبلازمية تاو. وعلاوة علي ذلك ، فان الوظائف المنسوبة إلى جزيئات تاو في المقصورة النووية ، حتى الآن ، ليست سوي صله نسبيه لأنها تفتقر إلى دليل قاطع علي المشاركة المباشرة لبروتينات تاو النووية. وفي الواقع ، فان مشاركه تاو في التنقل من الرجعية أو في النسخ rrna أو في حماية الحمض النووي11،12،17،18،19 يمكن ان تفسر أيضا من خلال مساهمه الخلوية تاو أو تاثير العوامل الأخرى المصب غير المرتبطة تاو النووية.
هنا ، ونحن نقدم طريقه التي يمكن ان تحل هذه المسالة عن طريق استغلال الإجراءات الكلاسيكية لعزل المقصورة النووية مع استخدام يبني تاو 0N4R الموسومة التعريب النووي (NLS) أو إشارات التصدير النووية (NES). هذا النهج يلغي القضايا المعقدة المتعلقة بالمصنوعات اليدوية المحتملة بسبب امتداد جزيئات تاو من المقصورة السيتوبلازمية. وعلاوة علي ذلك ، فان بناء تاو-NLS و Tau-NES يحفز علي إثراء أو استبعاد جزيئات تاو من المقصورة النووية ، علي التوالي ، مما يوفر ضوابط ايجابيه وسلبيه لاشراك جزيئات تاو النووية في وظيفة محدده. والبروتوكول سهل من الناحية التقنية وهو يتالف من أساليب تقليديه وموثوق بها تنطبق علي نطاق واسع لدراسة الوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى ، المتمايزة ام لا ، مثل الخلايا السرطانية التي تعيد تنشيط تعبير تاو20،21. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا علي البروتينات الأخرى الموجودة في كل من السيتوبلاسما والنواة من أجل تشريح الوظائف البيولوجية المتعلقة بالمقصورات المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونحن نوضح طريقه لقياس تاثير بروتين تاو النووي علي التعبير الجيني. مع هذا بروتوكول المساهمة من [سيتوميك] [تاو] بقوة محدوده. الخطوات الهامه لهذا البروتوكول هي التالية: التفريق بين خلايا الورم الارومي العصبي البشري SY5Y ، والتجزئة تحت الخلوي وتوطين بروتين تاو في المقصورة النووية.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من “سكوولا نورمالي سوبريوري” (SNS14_B_DIPRIMIO ؛ SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically – The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer’s Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , (2012).
- Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?. Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
