Modulación de la localización subcelular Tau como herramienta para investigar la expresión de genes relacionados con enfermedades
Summary
El tau es una proteína neuronal presente tanto en el citoplasma, donde se une a los microtúbulos, como en el núcleo, donde ejerce funciones no convencionales, incluida la modulación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Aquí, describimos un método para investigar la función de Tau nuclear excluyendo cualquier interferencia proveniente de Tau citoplasma.
Abstract
Tau es una proteína de unión a microtúbulos expresada en las neuronas y su principal función conocida está relacionada con el mantenimiento de la estabilidad citoesquelética. Sin embargo, la evidencia reciente indicó que Tau está presente también en otros compartimentos subcelulares, incluyendo el núcleo donde está implicado en la protección del ADN, en la transcripción del ARNR, en la movilidad de los retrotransposones y en la organización estructural de la Nucleolo. Recientemente hemos demostrado que El Tau nuclear está involucrado en la expresión del gen VGluT1, sugiriendo un mecanismo molecular que podría explicar el aumento patológico de la liberación de glutamato en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Hasta hace poco, la participación de Tau nuclear en la modulación de la expresión de genes diana ha sido relativamente incierta y ambigua debido a limitaciones técnicas que impidieron la exclusión de la contribución de Tau citoplasmático o el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear. Para superar esta incertidumbre, desarrollamos un método para estudiar la expresión de genes diana modulados específicamente por la proteína nuclear Tau. Empleamos un protocolo que combina el uso de señales de localización y el fraccionamiento subcelular, permitiendo la exclusión de la interferencia de las moléculas citoplasmáticas Tau. Más notablemente, el protocolo es fácil y se compone de métodos clásicos y confiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células y condiciones celulares.
Introduction
Las funciones de la proteína Tau en el núcleo han despertado un interés significativo en los últimos años, ya que se ha demostrado que está estrechamente asociada con los ácidos nucleicos1,2,3,4,5,6. De hecho, un estudio reciente en todo el genoma demostró que Tau une secuencias de ADN génicas e intergénicas in vivo7. Se ha sugerido un papel en la organización nucleolar8,9,10,11. Además, se ha propuesto a Tau participar en la protección del ADN contra el estrés oxidativo e hipertérmico5,10,12,13, mientras que Tau mutado se ha relacionado con la inestabilidad cromosómica y la aneuploidía14,15,16.
Hasta ahora, los desafíos en el estudio de las funciones de Tau en el compartimento nuclear seguían casi sin resolver debido a las dificultades para disección de la contribución específica de Tau nuclear de la contribución de Tau citoplasmático. Además, las funciones atribuidas a las moléculas Tau en el compartimento nuclear, hasta ahora, son sólo correlativas porque carecen de una demostración inequívoca de la implicación directa de las proteínas nucleares Tau. De hecho, la participación de Tau en la movilidad de los retrotransposonos o en la transcripción del ARNr o en la protección del ADN11,12,17,18,19 podría explicarse también por la contribución de Tau citoflásico o por el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear.
Aquí, proporcionamos un método que puede resolver este problema mediante la explotación de un procedimiento clásico para aislar el compartimento nuclear combinado con el uso de las construcciones Tau 0N4R etiquetadas con localización nuclear (NLS) o señales de exportación nuclear (NES). Este enfoque elimina los problemas complejos relacionados con posibles artefactos debido a la derrame de moléculas Tau del compartimiento citoplasmático. Además, las construcciones Tau-NLS y Tau-NES inducen el enriquecimiento o la exclusión de moléculas Tau del compartimiento nuclear, respectivamente, proporcionando controles positivos y negativos para la implicación de moléculas nucleares Tau en una función específica. El protocolo es técnicamente fácil y está compuesto por métodos clásicos y fiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células, diferenciadas o no, como las células cancerosas que reactivan la expresión Tau20,21. Además, podría aplicarse también a otras proteínas que están presentes tanto en el citoplasma como en el núcleo con el fin de diseccionar funciones biológicas relacionadas con diferentes compartimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos un método para medir el impacto de la proteína nuclear Tau en la expresión génica. Con este protocolo la contribución de Tau citoplasma es muy limitada. Los pasos críticos de este protocolo son los siguientes: la diferenciación de las células sh-SY5Y del neuroblastoma humano, el fraccionamiento subcelular y la localización de la proteína Tau en el compartimento nuclear.
En primer lugar, como se muestra en la sección de resultados representativos, la diferenciación de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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