Summary

Modulación de la localización subcelular Tau como herramienta para investigar la expresión de genes relacionados con enfermedades

Published: December 20, 2019
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Summary

El tau es una proteína neuronal presente tanto en el citoplasma, donde se une a los microtúbulos, como en el núcleo, donde ejerce funciones no convencionales, incluida la modulación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Aquí, describimos un método para investigar la función de Tau nuclear excluyendo cualquier interferencia proveniente de Tau citoplasma.

Abstract

Tau es una proteína de unión a microtúbulos expresada en las neuronas y su principal función conocida está relacionada con el mantenimiento de la estabilidad citoesquelética. Sin embargo, la evidencia reciente indicó que Tau está presente también en otros compartimentos subcelulares, incluyendo el núcleo donde está implicado en la protección del ADN, en la transcripción del ARNR, en la movilidad de los retrotransposones y en la organización estructural de la Nucleolo. Recientemente hemos demostrado que El Tau nuclear está involucrado en la expresión del gen VGluT1, sugiriendo un mecanismo molecular que podría explicar el aumento patológico de la liberación de glutamato en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Hasta hace poco, la participación de Tau nuclear en la modulación de la expresión de genes diana ha sido relativamente incierta y ambigua debido a limitaciones técnicas que impidieron la exclusión de la contribución de Tau citoplasmático o el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear. Para superar esta incertidumbre, desarrollamos un método para estudiar la expresión de genes diana modulados específicamente por la proteína nuclear Tau. Empleamos un protocolo que combina el uso de señales de localización y el fraccionamiento subcelular, permitiendo la exclusión de la interferencia de las moléculas citoplasmáticas Tau. Más notablemente, el protocolo es fácil y se compone de métodos clásicos y confiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células y condiciones celulares.

Introduction

Las funciones de la proteína Tau en el núcleo han despertado un interés significativo en los últimos años, ya que se ha demostrado que está estrechamente asociada con los ácidos nucleicos1,2,3,4,5,6. De hecho, un estudio reciente en todo el genoma demostró que Tau une secuencias de ADN génicas e intergénicas in vivo7. Se ha sugerido un papel en la organización nucleolar8,9,10,11. Además, se ha propuesto a Tau participar en la protección del ADN contra el estrés oxidativo e hipertérmico5,10,12,13, mientras que Tau mutado se ha relacionado con la inestabilidad cromosómica y la aneuploidía14,15,16.

Hasta ahora, los desafíos en el estudio de las funciones de Tau en el compartimento nuclear seguían casi sin resolver debido a las dificultades para disección de la contribución específica de Tau nuclear de la contribución de Tau citoplasmático. Además, las funciones atribuidas a las moléculas Tau en el compartimento nuclear, hasta ahora, son sólo correlativas porque carecen de una demostración inequívoca de la implicación directa de las proteínas nucleares Tau. De hecho, la participación de Tau en la movilidad de los retrotransposonos o en la transcripción del ARNr o en la protección del ADN11,12,17,18,19 podría explicarse también por la contribución de Tau citoflásico o por el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear.

Aquí, proporcionamos un método que puede resolver este problema mediante la explotación de un procedimiento clásico para aislar el compartimento nuclear combinado con el uso de las construcciones Tau 0N4R etiquetadas con localización nuclear (NLS) o señales de exportación nuclear (NES). Este enfoque elimina los problemas complejos relacionados con posibles artefactos debido a la derrame de moléculas Tau del compartimiento citoplasmático. Además, las construcciones Tau-NLS y Tau-NES inducen el enriquecimiento o la exclusión de moléculas Tau del compartimiento nuclear, respectivamente, proporcionando controles positivos y negativos para la implicación de moléculas nucleares Tau en una función específica. El protocolo es técnicamente fácil y está compuesto por métodos clásicos y fiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células, diferenciadas o no, como las células cancerosas que reactivan la expresión Tau20,21. Además, podría aplicarse también a otras proteínas que están presentes tanto en el citoplasma como en el núcleo con el fin de diseccionar funciones biológicas relacionadas con diferentes compartimentos.

Protocol

1. Cultivo celular Cultivo de células SH-SY5Y (línea celular de neuroblastoma humano, CRL-2266) en medio completo (medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada con 10% de suero bovino fetal [FBS], 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomícica). Mantener las células en una incubadora a 37oC y 5%co2. Cultivar células en placas de 10 cm y dividir cuando confluente. 2. Diferenciación celular …

Representative Results

La estrategia utilizada para diseccionar el impacto del Tau nuclear en la expresión génica evitando la contribución de las proteínas tau citoflásmicas se ha representado en la Figura 1. Brevemente, las proteínas Tau etiquetadas con NLS o NES se acumulan o excluyen del compartimento nuclear, respectivamente. El efecto funcional de este desequilibrio es la alteración de la expresión génica medida como el producto del gen VGluT1. <p class="jove_cont…

Discussion

Describimos un método para medir el impacto de la proteína nuclear Tau en la expresión génica. Con este protocolo la contribución de Tau citoplasma es muy limitada. Los pasos críticos de este protocolo son los siguientes: la diferenciación de las células sh-SY5Y del neuroblastoma humano, el fraccionamiento subcelular y la localización de la proteína Tau en el compartimento nuclear.

En primer lugar, como se muestra en la sección de resultados representativos, la diferenciación de la…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH=8 0.5M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/ml, 100ml
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

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Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

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