Summary

Modulatie van Tau Subcellulaire lokalisatie als een instrument om de uitdrukking van ziektegerelateerde genen te onderzoeken

Published: December 20, 2019
doi:

Summary

Tau is een neuronale eiwit aanwezig zowel in het cytoplasma, waar het bindt microtubuli, en in de Nucleus, waar het oefent onconventionele functies, met inbegrip van de modulatie van de ziekte van Alzheimer-gerelateerde genen. Hier beschrijven we een methode om de functie van nucleaire tau te onderzoeken, terwijl alle interferenties uit cytoplasmatische tau worden uitgesloten.

Abstract

Tau is een microtubulus bindend eiwit uitgedrukt in neuronen en de belangrijkste bekende functie is gerelateerd aan het behoud van cytoskelet stabiliteit. Recent bewijs gaf echter aan dat tau ook aanwezig is in andere subcellulaire compartimenten, waaronder de Nucleus waar het betrokken is bij DNA-bescherming, in rRNA transcriptie, in de mobiliteit van retrotransposons en in de structuur organisatie van de Nucleolus. We hebben onlangs aangetoond dat nucleaire Tau is betrokken bij de uitdrukking van het VGluT1 gen, suggereren een moleculair mechanisme dat de pathologische toename van glutamaat vrijlating in de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer verklaren kan. Tot voor kort was de betrokkenheid van nucleaire tau bij het moduleren van de uitdrukking van doel genen relatief onzeker en dubbelzinnig vanwege technische beperkingen die de uitsluiting van de bijdrage van cytoplasmische tau of het effect van andere downstream-factoren die geen verband houden met nucleaire tau. Om deze onzekerheid te overwinnen, ontwikkelden we een methode om de expressie van doel genen te bestuderen die specifiek zijn gemoduleerd door het nucleaire Tau-eiwit. We werkten met een protocol dat koppels het gebruik van lokalisatie signalen en de subcellulaire fractionering, waardoor de uitsluiting van de interferentie van de cytoplasmatische tau moleculen. Met name is het protocol eenvoudig en bestaat uit klassieke en betrouwbare methoden die algemeen toepasbaar zijn om de nucleaire functie van tau in andere celtypen en cellulaire omstandigheden te bestuderen.

Introduction

De functies van Tau-eiwit in de Nucleus hebben de afgelopen jaren aanzienlijke belangstelling gekregen, omdat is aangetoond dat het nauw geassocieerd is met nucleïnezuren1,2,3,4,5,6. Inderdaad, een recente genoom-brede studie toonde aan dat tau genic en intergene DNA-sequenties bindt in vivo7. Een rol in de nucleolar organisatie is voorgesteld8,9,10,11. Bovendien is tau voorgesteld om betrokken te zijn bij DNA-bescherming tegen oxidatieve en hyperthermische stress5,10,12,13, terwijl gemuteerde Tau is gekoppeld aan chromosoominstabiliteit en aneuploïdie14,15,16.

Tot nu toe bleven de uitdagingen bij het bestuderen van de functies van tau in het nucleaire compartiment bijna onopgelost vanwege de moeilijkheden bij het ontleden van de specifieke bijdrage van nucleaire tau uit de bijdrage van cytoplasmatische tau. Bovendien zijn de functies die aan tau-moleculen in het nucleaire compartiment worden toegeschreven tot nu toe slechts correlatief omdat ze geen eenduidige demonstratie hebben van de directe betrokkenheid van nucleaire tau-eiwitten. De betrokkenheid van Tau bij de mobiliteit van retrotransposons of in de transcriptie van de rRNA of in de DNA-bescherming11,12,17,18,19 kan ook worden verklaard door de bijdrage van cytoplasmatische tau of door het effect van andere downstream factoren die geen verband houden met nucleaire tau.

Hier bieden we een methode om dit probleem op te lossen door een klassieke procedure te benutten om het nucleaire compartiment te isoleren in combinatie met het gebruik van Tau-constructies 0N4R gelabeld met nucleaire lokalisatie (NLS) of nucleaire export signalen (NES). Deze aanpak elimineert de complexe problemen met betrekking tot mogelijke artefacten als gevolg van de overloop van tau moleculen uit het cytoplasmische compartiment. Bovendien veroorzaken tau-NLS en tau-NES constructies de verrijking of uitsluiting van tau-moleculen uit het nucleaire compartiment, en leveren zij positieve en negatieve controles op de betrokkenheid van nucleaire tau-moleculen in een specifieke functie. Het protocol is technisch eenvoudig en bestaat uit klassieke en betrouwbare methoden die algemeen toepasbaar zijn om de nucleaire functie van tau in andere celtypen te bestuderen, gedifferentieerd of niet, zoals kankercellen die tau-expressie20,21opnieuw activeren. Bovendien, het kan ook worden toegepast op andere eiwitten die aanwezig zijn in zowel het cytoplasma en de Nucleus om te ontleden van biologische functies die verband houden met verschillende compartimenten.

Protocol

1. celcultuur Cultuur SH-SY5Y cellen (menselijke neuroblastoom cellijn, CRL-2266) in het volledige medium (Dulbecco’s gemodificeerde adelaar medium: nutriënten mengsel F12 [DMEM/F-12] aangevuld met 10% foetaal runderserum [FBS], 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine). Houd de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweekcellen in 10 cm platen en splits bij Confluent. 2. celdifferentiatie Om te differentiëren SH-SY5Y cell…

Representative Results

De strategie voor het ontleden van de impact van nucleaire tau in genexpressie die de bijdrage van cytoplasmische tau-eiwitten vermijdt, is afgebeeld in Figuur 1. In het kort worden tau-eiwitten die met NLS of NES zijn gelabeld, samengevoegd in of uitgesloten van het nucleaire compartiment. Het functionele effect van deze onbalans is de verandering van de genexpressie, gemeten als het product van het VGluT1 gen. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi…

Discussion

We beschrijven een methode om de impact van nucleaire tau-eiwitten op genexpressie te meten. Met dit protocol de bijdrage van cytoplasmatische Tau is sterk beperkt. Kritieke stappen van dit protocol zijn de volgende: de differentiatie van menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen, de subcellulaire fractionering en de lokalisatie van Tau-eiwit in het nucleaire compartiment.

Ten eerste is, zoals blijkt uit de representatieve resultaten sectie, de differentiatie van de SH-SY5Y cellen door het toevo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door subsidies van Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH=8 0.5M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/ml, 100ml
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

References

  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically – The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer’s Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?. Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Play Video

Cite This Article
Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

View Video