Modulação da localização subcelular tau como uma ferramenta para investigar a expressão de genes relacionados à doença
Summary
Tau é uma proteína neuronal presente tanto no citoplasma, onde liga microtúbulos, e no núcleo, onde exerce funções não convencionais, incluindo a modulação dos genes relacionados à doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos um método para investigar a função do tau nuclear, excluindo quaisquer interferências provenientes de Tau citoplasmamic.
Abstract
Tau é uma proteína de ligação microtúnuo expressa nos neurônios e sua principal função conhecida está relacionada à manutenção da estabilidade citosquelética. No entanto, evidências recentes indicaram que Tau também está presente em outros compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo onde está implicado na proteção do DNA, na transcrição do rRNA, na mobilidade de retrotransposons e na organização estrutural do Nucléolo. Recentemente, demonstramos que tau nuclear está envolvido na expressão do gene VGluT1, sugerindo um mecanismo molecular que poderia explicar o aumento patológico da liberação de glutamato nos estágios iniciais da doença de Alzheimer. Até recentemente, o envolvimento do tau nuclear na modulação da expressão de genes-alvo tem sido relativamente incerto e ambíguo devido a limitações técnicas que impediram a exclusão da contribuição de Tau citoplasmic ou o efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau. Para superar essa incerteza, desenvolvemos um método para estudar a expressão de genes-alvo especificamente modulados pela proteína tau nuclear. Nós empregamos um protocolo que acople o uso de sinais da localização e do fration subcellular, permitindo a exclusão da interferência das moléculas citoplasmômicas de Tau. Mais notavelmente, o protocolo é fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis para estudar a função nuclear de Tau em outros tipos de células e condições celulares.
Introduction
As funções da proteína Tau no núcleo têm atraído interesse significativo nos últimos anos, uma vez que tem se mostrado intimamente associada com os ácidos nucleicos1,2,3,4,5,6. Na verdade, um estudo recente em todo o genoma demonstrou que Tau liga seqüências de DNA genic e intergênicos in vivo7. Um papel na organização nucleolar foi sugerido8,9,10,11. Além disso, Tau foi proposto para se envolver na proteção do DNA contra o estresse oxidativo e hipertermiômico5,10,12,13, enquanto tau mutado tem sido associada à instabilidade cromossômica e aneuploide14,15,16.
Até agora, os desafios em estudar as funções de Tau no compartimento nuclear permaneceram quase sem solução devido às dificuldades em dissecar a contribuição específica de Tau nuclear da contribuição de Tau citoplasmic. Além disso, as funções atribuídas às moléculas tau no compartimento nuclear, até agora, são apenas correlativas porque não têm uma demonstração inequívoca do envolvimento direto das proteínas nucleares Tau. De fato, o envolvimento de Tau na mobilidade de retrotransposons ou na transcrição rRNA ou na proteção do DNA11,12,17,18,19 também pode ser explicado pela contribuição de Tau citoplasmic ou pelo efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau.
Aqui, fornecemos um método que pode resolver este problema explorando um procedimento clássico para isolar o compartimento nuclear combinado com o uso de tau constrói 0N4R marcado com localização nuclear (NLS) ou sinais de exportação nuclear (NES). Esta abordagem elimina as questões complexas relacionadas com possíveis artefatos devido à repercussão das moléculas tau do compartimento citoplasmático. Além disso, as construções Tau-NLS e Tau-NES induzem o enriquecimento ou a exclusão das moléculas tau do compartimento nuclear, respectivamente, fornecendo controles positivos e negativos para o envolvimento de moléculas nucleares tau em uma função específica. O protocolo é tecnicamente fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis ao estudo da função nuclear de Tau em outros tipos de células, diferenciados ou não, como células cancerosas que reativam a expressão tau20,21. Além disso, pode ser aplicado também a outras proteínas que estão presentes tanto no citoplasma quanto no núcleo, a fim de dissecar funções biológicas relacionadas a diferentes compartimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um método para medir o impacto da proteína tau nuclear na expressão gênica. Com este protocolo, a contribuição do tau citoplasmic é fortemente limitada. Os passos críticos deste protocolo são os seguintes: a diferenciação das células neuroblastoma humana SH-SY5Y, o fracionamento subcelular e a localização da proteína Tau no compartimento nuclear.
Primeiro, como mostrado na seção de resultados representativos, a diferenciação das células SH-SY5Y, adicionando RA e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por doações da Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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