Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung
Summary
Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.
Abstract
Circular RNAs (circRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs, die an Funktionen wie Mikro-RNA-Regulierung (miRNA), Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt sind. In der klassischen RNA-Sequenzierung der nächsten Generation (RNA-seq) werden CircRNAs in der Regel als Ergebnis der Poly-A-Auswahl während des Aufbaus von mRNA-Bibliotheken übersehen oder sind in sehr geringer Häufigkeit zu finden und daher schwer zu isolieren und zu erkennen. Hier wurde ein circRNA-Bibliotheksbauprotokoll optimiert, indem Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und verschiedene gesamte RNA-Eingangsmengen verglichen wurden. Getestet wurden zwei handelsübliche Volltranskriptom-Bibliotheksvorbereitungskits mit und ohne RNase R-Vorbehandlung und unter Verwendung variabler Mengen des gesamten RNA-Eingangs (1 bis 4 g). Schließlich, mehrere Gewebetypen; einschließlich Leber, Lunge, Lymphknoten und Bauchspeicheldrüse; sowie mehrere Hirnregionen; einschließlich des Kleinhirns, des minderwertigen parietalen Lappens, des mittleren zeitlichen Gyrus, des okzipitalen Kortex und des überlegenen frontalen Gyrus; wurden verglichen, um die Häufigkeit von ZirkRNA über Gewebetypen hinweg zu bewerten. Die Analyse der generierten RNA-Seq-Daten mit sechs verschiedenen circRNA-Detektionswerkzeugen (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC und CIRCexplorer) ergab, dass ein gestrandetes Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitungskit mit RNase R-Vorbehandlung und 4-g-RNA-Eingang der optimale Methode zur Identifizierung der höchsten relativen Anzahl von circRNAs. Im Einklang mit früheren Befunden wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs in Hirngeweben im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.
Introduction
Circular RNAs (CircRNAs) sind endogene, nicht-kodierende RNAs, die aufgrund ihrer allgegenwärtigen Expression im eukaryotischen Transkriptom1,2,3Aufmerksamkeit erlangt haben. Sie werden gebildet, wenn exons zurück zueinander und daher wurden zunächst als spleißende Artefakte4,5. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass CircRNAs Zelltyp, Gewebe und Entwicklungsstadium spezifische Expression3,6 aufweisen und evolutionär konserviert sind2,3. Darüber hinaus sind sie an der Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen7, Mikro-RNA (miRNA) Bindung3,8,9,10, und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt11.
Bei der klassischen RNA-Sequenzierung (RNA-seq) können CircRNAs während des Bibliotheksbaus als Folge der Poly-A-Auswahl für mRNAs vollständig verloren gehen oder aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwer zu isolieren sein. Jüngste CircRNA-Charakterisierungsstudien haben jedoch einen Vorbehandlungsschritt mit RNase R integriert, um für circRNAs2,12,13anzureichern. RNase R ist eine Exoribonuklease, die lineare RNAs verdaut und kreisförmige RNA-Strukturen hinterlässt. CircRNA-Anreicherungsprotokolle wurden optimiert, indem Daten aus zwei kommerziell erhältlichen Gesamt-Transkriptom-Bibliotheksbausätzen mit und ohne RNase R-Vorbehandlungsschritt generiert und verglichen wurden und unterschiedliche Mengen an RNA-Eingang (1 bis 4 g) verwendet wurden. Das optimierte Protokoll wurde als nächstes verwendet, um die Häufigkeit von CircRNAs in fünf verschiedenen Hirnregionen (Kleinhirn [BC], minderwertiger parietaler Lappen [IP], mittlerer zeitlicher Gyrus [MG], okzipitaler Kortex [OC] und überlegener frontaler Gyrus [SF]) und vier anderen Gewebetypen (Leber [LV], Lunge [LU], Lymphknoten [LN] und Bauchspeicheldrüse [PA]) zu bewerten. RNA-Seq-Bibliotheken wurden am Ende sequenziert und die Daten wurden mit sechs verschiedenen circRNA-Vorhersagealgorithmen analysiert: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17und CIRCexplorer18. Basierend auf unserer Analyse wurde die höchste Anzahl einzigartiger CircRNAs bei der Verwendung eines gestrandeten gesamten RNA-Bibliotheksvorbereitungskits mit RNase R-Vorbehandlung und 4 g Gesamt-Input-RNA nachgewiesen. Das optimierte Protokoll wird hier beschrieben. Wie bereits berichtet19,20, wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurden zwei kommerziell erhältliche Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und Eingangs-RNA-Mengen getestet, um ein circRNA-Anreicherungsprotokoll für den Bau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken zu optimieren. Basierend auf den Bewertungen dieser Studie sind eine Reihe wichtiger Aspekte und kritische Schritte bei der Erstellung von circRNA-Sequenzierungsbibliotheken offensichtlich. Unsere Bewertung bestätigt den Nutzen der RNase R-Vorbehandlung, was sich in der erhöhten Anzahl der na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) in Sun City, Arizona, für die Bereitstellung von menschlichem Hirngewebe. Das BBDP wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson es Disease and Related Disorders), dem National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer es Disease Core Center), dem Arizona Department of Health Services (Vertrag 211002, Arizona Alzheimer es Research Center), die Arizona Biomedical Research Commission (Verträge 4001, 0011, 05-901 und 1001 an das Arizona Parkinson es Disease Consortium) und das Michael J. Fox Foundation for Parkinson es Research27. Diese Studie wurde auch vom DHS und dem Bundesstaat Arizona unterstützt (ADHS-Stipendium ADHS14-052688). Wir danken auch Andrea Schmitt (Banner Research) und Cynthia Lechuga (TGen) für die administrative Unterstützung.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
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