Идентификация циркулярных РНК с использованием секвенирования РНК
Summary
Круговые РНК (циркрнки) являются некодирующие РНК, которые могут иметь роль в транскрипционной регуляции и посредничестве взаимодействий между белками. После оценки различных параметров для строительства библиотек секвенирования циркрнки был составлен протокол с использованием застрявшей общей подготовки библиотеки РНК с помощью предварительной обработки RNase R и представлен здесь.
Abstract
Циркулярные РНК (circRNAs) представляют собой класс некодирующих РНК, участвующих в функциях, включая регулирование микроРНК (miRNA), посредничество белково-белковых взаимодействий и регуляцию скррижки генов родителей. В классическом следующем поколении секвенирования РНК (РНК-сек), циркрнки, как правило, упускается из виду в результате выбора поли-A во время строительства библиотек мРНК, или находятся в очень низком изобилии, и поэтому трудно изолировать и обнаружить. Здесь был оптимизирован протокол строительства библиотеки circRNA путем сравнения комплектов подготовки библиотек, вариантов предварительной обработки и различных общих объемов ввода РНК. Были протестированы два коммерчески доступных целых комплекта подготовки библиотеки транскриптома, с и без RNase R предварительной обработки, а также с использованием переменных количеств общего объема РНК-ввода (1 до 4 мкг). Наконец, несколько типов тканей; включая печень, легкие, лимфатические узлы и поджелудочную железу; а также несколько областей мозга; включая мозжечок, нижнюю теменной доли, среднюю височную извилину, затылочную кору и превосходную лобную извилину; были сравнена для оценки изобилия циркрнки по типам тканей. Анализ генерируемых данных РНК-сек с использованием шести различных инструментов обнаружения циркрнки (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC и CIRCexplorer) показал, что полный комплект подготовки библиотеки РНК с RNase R предварительной обработкой и 4 мкг РНК-ввода является оптимальным метод определения наивысшего относительного числа циркрн. В соответствии с предыдущими выводами, наибольшее обогащение циркрнков наблюдалось в тканях мозга по сравнению с другими типами тканей.
Introduction
Круговые РНК (CircRNAs) являются эндогенными, не кодирующих РНК, которые привлекли внимание, учитывая их широкое выражение в эукариотической транскриптоме1,2,3. Они образуются, когда экзоны обратно-сращивания друг к другу и, следовательно, первоначально считались сращивания артефактов4,5. Тем не менее, недавние исследования показали, что циркрнки экспонат авт., ткани, и стадии развития специфической экспрессии3,6 и эволюционно сохранены2,3. Кроме того, они участвуют в посредничестве белково-белковых взаимодействий7,микроРНК (miRNA) связывания3,8,9,10,и регуляции скрушины генов родительских11.
В классическом секвенировании РНК (РНК-сек) циркрнки могут быть полностью потеряны при строительстве библиотеки в результате выбора поли-А для мРНК или могут быть трудно изолировать, учитывая их низкое изобилие. Тем не менее, последние исследования характеристик циркрнки включили предварительный этап лечения с использованием RNase R для того, чтобы обогатить для цирка2,12,13. RNase R является экзорибонуклеазом, который переваривает линейные РНК, оставляя за собой круговые структуры РНК. Протоколы обогащения CircRNA были оптимизированы путем генерации и сравнения данных из двух коммерчески доступных целых комплектов транскриптомной библиотеки, с шагом предварительной обработки RNase R и без него, а также с использованием различных количеств общего объема ввода РНК (от 1 до 4 мкг). Оптимизированный протокол затем использовался для оценки обилия циркрнков в пяти различных областях мозга (мозжечок ,BC), нижняя теметельная доля «IP», средняя височная извилина «Mg», затылочная кора и превосходная лобная извилина »SF» и четыре других типа тканей (liver (ПА) , легочная « LU», лимфальное узели). Библиотеки RNA-seq были сопряжены с последовательностью конца и данные были проанализированы с помощью шести различных алгоритмов прогнозирования циркуляции: find_circ3,CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, и CIRCexplorer18. На основе нашего анализа, наибольшее количество уникальных циркрнков было обнаружено при использовании мель общей РНК комплект подготовки библиотеки с RNase R предварительной обработки и 4 мкг общего ввода РНК. Оптимизированный протокол описан здесь. Как сообщалось ранее19,20, наибольшее обогащение циркрнков наблюдалось в головном мозге по сравнению с другими типами тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании были протестированы два коммерчески доступных комплекта для подготовки библиотек, варианты предварительной обработки и количество входной РНК для оптимизации протокола обогащения циркрнки для строительства библиотек секвенирования циркрнки. На основе оценок эт…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) из Сан-Сити, штат Аризона, за предоставление тканей мозга человека. BBDP была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (U24 NS072026 Национальный мозг и ткани ресурс для болезни Паркинсона и связанных с ними расстройств), Национальный институт по проблемам старения (P30AG19610 Аризона болезнь Альцгеймера Основной центр), Аризона Департамент здравоохранения (контракт 211002, Аризона Альцгеймера исследовательский центр), Аризона биомедицинских исследований комиссии (контракты 4001, 0011, 05-901 и 1001 в Аризоне Паркинсона болезни консорциума) и Майкл J. Фокс Фонд исследований Паркинсона27. Это исследование было также поддержано DHS и штата Аризона (ADHS гранта ADHS14-052688). Мы также благодарим Андреа Шмитт (Banner Research) и Синтию Лечуга (TGen) за административную поддержку.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
