Identification des ARN circulaires à l'aide du séquençage de l'ARN
Summary
Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN non codants qui peuvent avoir des rôles dans la régulation transcriptionnelle et la médiation des interactions entre les protéines. Après l’évaluation de différents paramètres pour la construction des bibliothèques de séquençage circRNA, un protocole a été compilé utilisant la préparation totale échouée de bibliothèque d’ARN avec RNase R pré-traitement et est présenté ici.
Abstract
Les ARN circulaires (circRNAs) sont une classe d’ARN non codants impliqués dans des fonctions telles que la régulation des micro-ARN (miRNA), la médiation des interactions protéines-protéines et la régulation de la transcription des gènes parentaux. Dans le séquençage classique de l’ARN de prochaine génération (ARN-seq), les circARN sont généralement négligés en raison de la sélection poly-A lors de la construction des bibliothèques d’ARNm, ou se trouvent à très faible abondance, et sont donc difficiles à isoler et à détecter. Ici, un protocole de construction de la bibliothèque circRNA a été optimisé en comparant les trousses de préparation de la bibliothèque, les options de prétraitement et diverses quantités totales d’entrée d’ARN. Deux trousses de préparation de la bibliothèque de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans prétraitement R, et utilisant des quantités variables d’entrée totale d’ARN (1 à 4 g), ont été testées. Enfin, plusieurs types de tissus; y compris le foie, les poumons, les ganglions lymphatiques et le pancréas; ainsi que de multiples régions du cerveau; y compris le cervelet, le lobe pariétal inférieur, le gyrus temporel moyen, le cortex occipital, et le gyrus frontal supérieur ; ont été comparés pour évaluer l’abondance de circRNA à travers des types de tissu. L’analyse des données ARN-seq générées à l’aide de six différents outils de détection de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC et CIRCexplorer) a révélé qu’une trousse de préparation totale de la bibliothèque d’ARN échouée avec le prétraitement R r et l’entrée d’ARN de 4 g est l’entrée optimale de l’ARN pour identifier le plus grand nombre relatif de circRNAs. Conformément aux résultats précédents, l’enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans les tissus de cerveau comparés à d’autres types de tissu.
Introduction
Les ARN circulaires (CircRNAs) sont des ARN endogènes et non codants qui ont retenu l’attention compte tenu de leur expression omniprésente dans la transcriptome eucaryotique1,2,3. Ils sont formés lorsque les exons dos-épissage à l’autre et ont donc été initialement considérés comme des artefacts épissage4,5. Cependant, des études récentes ont démontré que les circRNAs présentent le type de cellule, le tissu, et l’expression spécifique de stade développemental3,6 et sont évolutivement conservés2,3. En outre, ils sont impliqués dans la médiation des interactions protéine-protéine7, micro-ARN (miRNA) liant3,8,9,10, et la régulation de la transcription des gènes parentaux11.
Dans le séquençage classique d’ARN (ARN-seq), les circRNAs peuvent être complètement perdus pendant la construction de bibliothèque en raison de la sélection de poly-A pour des ARNM ou peuvent être difficiles à isoler étant donné leur faible abondance. Cependant, des études récentes de caractérisation circRNA ont incorporé une étape de pré-traitement en utilisant RNase R afin d’enrichir pour les circRNAs2,12,13. RNase R est une exoribonucane qui digère les ARN linéaires, laissant derrière elle des structures circulaires d’ARN. Les protocoles d’enrichissement de CircRNA ont été optimisés en générant et en comparant les données de deux kits de construction de bibliothèques de transcriptome entièrement disponibles dans le commerce, avec et sans étape de prétraitement R R, et en utilisant des quantités variables d’entrée totale d’ARN (1 à 4 g). Le protocole optimisé a ensuite été utilisé pour évaluer l’abondance des circARN dans cinq régions différentes du cerveau (cerebellum [BC], lobe pariétal inférieur [IP], gyrus temporel moyen [MG], cortex occipital [OC] et gyrus frontal supérieur [SF]) et quatre autres types de tissus (foie [LV], poumon [LU], ganglion [LN] et pancréas[PA]). Les bibliothèques RNA-seq ont été appariées fin séquencée et les données ont été analysées à l’aide de six algorithmes de prédiction circRNA différents: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, et CIRCexplorer18. Sur la base de notre analyse, le plus grand nombre de circRNAs uniques a été détecté lors de l’utilisation d’une trousse de préparation totale échouée de bibliothèque d’ARN avec RNase R pré-traitement et 4 arn d’entrée total. Le protocole optimisé est décrit ici. Comme précédemment rapporté19,20, l’enrichissement le plus élevé des circRNAs a été observé dans le cerveau par rapport à d’autres types de tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le cadre de cette étude, deux trousses de préparation de bibliothèques disponibles dans le commerce, des options de prétraitement et des quantités d’ARN d’entrée ont été testées afin d’optimiser un protocole d’enrichissement de l’ARNrc pour la construction de bibliothèques de séquençage circRNA. D’après les évaluations de cette étude, un certain nombre d’aspects clés et d’étapes critiques dans la création de bibliothèques de séquençage circRNA sont apparents. Notre évaluation confirme l’utilit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants au Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) de Sun City, arizona pour la fourniture de tissus cérébraux humains. Le BBDP a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson’s Disease and Related Disorders), le National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer’s Disease Core Center), l’Arizona Department of Health Services (contrat 211002, Arizona Alzheimer’s Research Center), l’Arizona Biomedical Research Commission (contrats 4001, 0011, 05-901 et 1001 au Arizona Parkinson’s Disease Consortium) et le Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research27. Cette étude a également été soutenue par le DHS et l’État de l’Arizona (subvention adhS14-052688). Nous remercions également Andrea Schmitt (Banner Research) et Cynthia Lechuga (TGen) pour leur soutien administratif.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
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