Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN
Summary
Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.
Abstract
Los ARN circulares (circARN) son una clase de ARN no codificantes que participan en funciones que incluyen la regulación del microARN (miRNA), la mediación de interacciones proteínas y proteínas y la regulación de la transcripción genética parental. En la secuenciación clásica de ARN de próxima generación (RNA-seq), los círculos se pasan por alto típicamente como resultado de la selección de poli-A durante la construcción de bibliotecas de ARNm, o se encuentran en muy baja abundancia, y por lo tanto son difíciles de aislar y detectar. Aquí, se optimizó un protocolo de construcción de la biblioteca de circRNA comparando kits de preparación de bibliotecas, opciones de pretratamiento y varias cantidades totales de entrada de ARN. Se probaron dos kits de preparación de bibliotecas de transcriptomes completos disponibles en el uso comercial, con y sin pretratamiento de RNase R, y utilizando cantidades variables de entrada total de ARN (1 a 4 g). Por último, múltiples tipos de tejido; incluyendo hígado, pulmón, ganglio linfático y páncreas; así como múltiples regiones cerebrales; incluyendo el cerebelo, el lóbulo parietal inferior, el giso temporal medio, la corteza occipital y el giso frontal superior; se compararon para evaluar la abundancia de circARN a través de tipos de tejidos. El análisis de los datos de ARN-seq generados utilizando seis herramientas diferentes de detección de ARN (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC y CIRCexplorer) reveló que un kit de preparación de la biblioteca de ARN total varado con pretratamiento RNase R y entrada de ARN de 4 g es el óptimo método para identificar el mayor número relativo de circRNAs. De acuerdo con los hallazgos anteriores, se observó el mayor enriquecimiento de los circRNAs en los tejidos cerebrales en comparación con otros tipos de tejidos.
Introduction
Los ARN circulares (ArnNA) son ARN endógenos y no codificantes que han ganado atención dada su expresión generalizada en el transcriptoma eucariota1,2,3. Se forman cuando los exons se empalman entre sí y por lo tanto se consideraron inicialmente como artefactos de empalme4,5. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los circRNAs exhiben tipo de célula, tejido y etapa específica del desarrollo expresión específica3,6 y se conservan evolutivamente2,3. Además, participan en la mediación de interacciones proteína-proteína7,la unión de microARN (miRNA)3,8,9,10, y la regulación de la transcripción genética parental11.
En la secuenciación clásica de ARN (RNA-seq), los círculos pueden perderse por completo durante la construcción de la biblioteca como resultado de la selección de poli-A para ARNm o pueden ser difíciles de aislar dada su baja abundancia. Sin embargo, estudios recientes de caracterización de circRNA han incorporado un paso de pretratamiento utilizando RNase R con el fin de enriquecer para circRNAs2,12,13. RNase R es una exoribonucleasa que digiere los ARN lineales, dejando atrás estructuras circulares de ARN. Los protocolos de enriquecimiento de CircRNA se optimizaron generando y comparando datos de dos kits de construcción de bibliotecas de transcriptomes completos disponibles comercialmente, con y sin un paso de pretratamiento RNase R, y utilizando cantidades variables de entrada total de ARN (1 a 4 g). El protocolo optimizado se utilizó a continuación para evaluar la abundancia de circRNAs en cinco regiones cerebrales diferentes (cerebelo [BC], lóbulo parietal inferior [IP], giso temporal medio [MG], corteza occipital [OC] y gros frontal superior [SF]) y otros cuatro tipos de tejido (hígado [LV], pulmón [LU], ganglio linfático [LN] y páncreas [PA]). Las bibliotecas RNA-seq se emparejaron secuenciadas finales y los datos se analizaron utilizando seis algoritmos de predicción de circRNA diferentes: find_circ3, CIRI14,Mapsplice15,KNIFE16, DCC17y CIRCexplorer18. Según nuestro análisis, se detectó el mayor número de circRNAs únicos cuando se utilizó un kit de preparación de la biblioteca de ARN total varado con pretratamiento RNase R y ARN de entrada total de 4 g. El protocolo optimizado se describe aquí. Como se informó anteriormente19,20, el mayor enriquecimiento de los círculos en el cerebro en comparación con otros tipos de tejido.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se probaron dos kits de preparación de bibliotecas disponibles comercialmente, opciones de pretratamiento y cantidades de ARN de entrada con el fin de optimizar un protocolo de enriquecimiento de circRNA para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA. Sobre la base de las evaluaciones de este estudio, una serie de aspectos clave y pasos críticos en la creación de bibliotecas de secuenciación de circRNA son evidentes. Nuestra evaluación confirma la utilidad del pretratamiento RNase…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos al Programa de Donación de Cerebros y Cuerpos del Instituto de Investigación de la Salud del Sol Banner (BBDP, por sus siglas en la) cuenta con el suministro de tejidos cerebrales humanos. El BBDP ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson’s Disease and Related Disorders), el National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer’s Disease Core Center), el Departamento de Servicios de Salud de Arizona (contrato 211002, Arizona Alzheimer’s Research Center), la Comisión de Investigación Biomédica de Arizona (contratos 4001, 0011, 05-901 y 1001 al Consorcio de Enfermedad de Parkinson de Arizona) y el Consorcio de Enfermedadde Parkinson de Arizona) y el Consorcio Michael J. Fundación Fox para la Investigación de Parkinson27. Este estudio también fue apoyado por el DHS y el Estado de Arizona (aun vez ala DeDHS 14-052688). También agradecemos a Andrea Schmitt (Banner Research) y Cynthia Lechuga (TGen) por su apoyo administrativo.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
