تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA
Summary
التعميم RNAs (circRNAs) هي غير الترميز RNAs التي قد يكون لها ادوار في التنظيم عبر المعاقين والتوسط التفاعلات بين البروتينات. بعد تقييم المعلمات المختلفة لبناء مكتبات التسلسل circRNA ، تم تجميع بروتوكول باستخدام مجموع تقطعت بهم السبل الجيش النيبالي اعداد المكتبة مع RNase R ما قبل العلاج ويرد هنا.
Abstract
التعميم RNAs (circRNAs) هي فئة من غير الترميز RNAs المشاركة في وظائف بما في ذلك مايكرو الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) التنظيم ، والوساطة من التفاعلات بروتين البروتين ، وتنظيم النسخ الجيني الابويه. في الجيل التالي الكلاسيكية RNA تسلسل (RNA-seq) ، يتم تجاهل circRNAs عاده نتيجة لاختيار بولي-A اثناء بناء المكتبات mRNA ، أو وجدت في وفره منخفضه جدا ، التالي من الصعب عزل وكشف. هنا ، تم تحسين بروتوكول إنشاء مكتبه circRNA عن طريق مقارنه مجموعات اعداد المكتبة ، وخيارات ما قبل العلاج ومختلف الكميات الاجماليه لإدخال الحمض الريبي النيبالي. وقد تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة المتاحة تجاريا ، مع وبدون RNase R قبل المعالجة ، وباستخدام كميات متغيرة من إجمالي دخل الحمض الريبي النيبالي (1 إلى 4 ميكروغرام). وأخيرا ، أنواع متعددة من الانسجه ؛ بما في ذلك الكبد, الرئة, العقدة الليمفاوية, والبنكرياس; فضلا عن مناطق الدماغ متعددة; بما في ذلك المخيخ ، والفص الجداري السفلي ، والجيروسكوبات الصدغية الوسطي ، والقشرة القذالي ، والجيروسكوبات الاماميه المتفوقة. تمت مقارنتها لتقييم وفره circRNA عبر أنواع الانسجه. تحليل البيانات التي تم إنشاؤها الحمض الريبي-seq باستخدام سته مختلفه circRNA أدوات الكشف (find_circ ، CIRI ، Mapsplice ، سكين ، DCC ، و سيرسيكسبلورير) كشفت ان مجموعه من الجيش النيبالي السماوي اعداد مكتبه مجموعه عده مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام الحمض الريبي المدخلات هو الأمثل طريقه لتحديد العدد النسبي الأعلى من circRNAs. وتماشيا مع النتائج السابقة ، لوحظت اعلي نسبه إثراء في انسجه المخ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.
Introduction
التعميم rnas (circrnas) هي الذاتية ، وغير الترميز rnas التي اكتسبت الاهتمام نظرا لتعبيرها المتفشي في الناسخة النواة1،2،3. يتم تشكيلها عندما الاكسون العودة لصق لبعضها البعض ، التالي اعتبرت في البداية ان تكون التحف الربط4،5. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات الاخيره ان circrnas المعرض نوع الخلية ، والانسجه ، والتنمية المرحلة المحددة التعبير3،6 ويتم الحفاظ علي التطور2،3. وعلاوة علي ذلك ، فهي تشارك في الوساطة من البروتين والبروتين التفاعلات7، الصغرى الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) ملزمه3،8،9،10، وتنظيم النسخ الجيني الابويه11.
في تسلسل RNA الكلاسيكية (الحمض الريبي النيبالي-seq) ، circRNAs قد تكون فقدت تماما اثناء بناء المكتبة نتيجة لاختيار بولي-A ل mRNAs أو قد يكون من الصعب عزل نظرا لوفره منخفضه. ومع ذلك ، فقد أدرجت الدراسات الحديثة لتوصيف الخصائص خطوه ما قبل المعالجة باستخدام rnase R من أجل إثراء circrna2،12،13. RNase R هو اكسوريبونوكليسي التي يهضم RNAs الخطية ، تاركا وراءها هياكل الحمض الريبي النيبالي الدائري. تم تحسين بروتوكولات التخصيب CircRNA عن طريق توليد ومقارنه البيانات من اثنين المتاحة تجاريا مجموعات البناء مكتبه النسخ ، مع وبدون خطوه RNase R قبل العلاج ، واستخدام كميات متفاوتة من الدخل الكلي RNA (1 إلى 4 ميكروغرام). وكان البروتوكول الأمثل تستخدم المقبل لتقييم وفره من circRNAs عبر خمس مناطق الدماغ المختلفة (المخيخ [BC] ، الفص الجداري السفلي [الملكية الفكرية] ، الجيروسكوب الصدغي الأوسط [MG] ، القشرة القذالي [OC] والجيروسكوب الامامي المتفوق [SF]) وأربعه أنواع أخرى من الانسجه (الكبد [LV] ، الرئة [LU] ، العقدة الليمفاوية [LN] والبنكرياس [PA]). وكانت المكتبات التي تليها الحمض الريبي النيبالي-المتسلسلة المتعاقبة وتحليل البيانات باستخدام سته مختلفه خوارزميات التنبؤ circRNA: find_circ3، ciri14، mapsplice15، سكين16، dcc17، و سيرسيكسبلورير18. واستنادا إلى تحليلنا ، تم الكشف عن أكبر عدد من circRNAs فريدة من نوعها عند استخدام مجموعه من الذين تقطعت بهم السبل اعداد مكتبه الحمض الريبي النيبالي مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام إجمالي المدخلات RNA. يتم وصف البروتوكول الأمثل هنا. كما ذكر سابقا19,20, لوحظ اعلي إثراء من circrnas في الدماغ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي هذه الدراسة ، تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبات المتاحة تجاريا ، وخيارات ما قبل المعالجة ، وكميات الحمض الريبي للإدخال من أجل تحسين بروتوكول إثراء circRNA لبناء مكتبات تسلسل circRNA. واستنادا إلى تقييمات هذه الدراسة ، فان عددا من الجوانب الرئيسية والخطوات الحاسمة في إنشاء مكتبات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لمعهد البحوث الصحية الشمس راية الدماغ والجسم برنامج التبرع (BBDP) من صن سيتي, ولاية اريزونا لتوفير انسجه المخ البشرية. وقد تم دعم BBDP من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (U24 NS072026 الوطنية الدماغ والانسجه الموارد لمرض باركنسون والاضطرابات ذات الصلة) ، المعهد الوطني للشيخوخة (P30AG19610 اريزونا مرض الزهايمر مركز الاساسيه), ولاية اريزونا قسم الخدمات الصحية (عقد 211002, اريزونا مركز البحوث الزهايمر), ولاية اريزونا لجنه البحوث الطبية الحيوية (عقود 4001, 0011, 05-901 و 1001 إلى اتحاد مرض باركنسون في ولاية اريزونا) ومايكل J. مؤسسه فوكس للبحوث باركنسون27. وقد دعمت هذه الدراسة أيضا من قبل وزاره التعليم الوطني وولاية اريزونا (ADHS منحه # ADHS14-052688). كما نشكر أندريا شميت (بحث بانر) وسينثيا ليهوغا (TGen) للدعم الإداري.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
