Обогащение и обнаружение Clostridium perfringens Токсинотипы в розничных образцов продуктов питания
Summary
Целью этого протокола является выявление различных Clostridium perfringens токсинотипов в локально приобретенных продуктов питания, в частности, эпсилон токсин производства штаммов типов B и D, без использования анаэробных камер.
Abstract
Clostridium perfringens (C. perfringens) является плодовитым производителем токсинов и вызывает широкий спектр заболеваний в различных хостах. C. perfringens делится на пять различных токсинотипов, A через Е, на основе перевозки четырех основных генов токсина. Распространенность и распространение этих различных токсинотипов недостаточно изучены, особенно их распространенность в американской розничной продовольственной. Особый интерес для нас представляют штаммы типа В и D, которые производят эпсилонный токсин, чрезвычайно смертоносный токсин, который предлагается срабатывать на экологическом спусковом крючке рассеянного склероза у людей. Для оценки присутствия различных C. perfringens токсинотипов в различных образцах продуктов питания, мы разработали простой метод выборочно культуры этих бактерий без использования анаэробной контейнерной системы только с участием трех шагов культивирования. Продукты питания закупаются в местных продуктовых магазинах и транспортируются в лабораторию в условиях окружающей среды. Образцы измельчаются и прививаются в модифицированные быстрые perfringens media (RPM) и инкубируются на ночь при 37 градусах Цельсия в герметичной, герметичной конической трубке. Ночные культуры прививаются на нижнем слое твердого триптозного сульфита Сулькузеприна (TSC), а затем накладываются верхним слоем расплавленного агара TSC, создавая «сэндвич», анаэробную среду. Агар пластины инкубируются на ночь при 37 градусов по Цельсию, а затем оцениваются на внешний вид черных, сульфит-снижающих колоний. C. perfringens-подозреваемыеколонии извлекаются из агара TSC с помощью стерильных капельниц глаз, и прививаются в RPM и субкультурные ночь при 37 градусов по Цельсию в герметичной конической трубке. ДНК извлекается из субкультуры RPM, а затем анализируется на наличие генов токсина C. perfringens с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В зависимости от типа пробы пищи, как правило, 15-20% образцов положительный результат теста на C. perfringens.
Introduction
Clostridium perfringens (C. perfringens) является Грам положительный, анаэробный, спорообразующих, стержня формы бактерии, которая находится повсеместно в окружающей среде. Этот вид бактерий несет гены, которые кодируют более 17 токсинов и, исторически, был охарактеризован в пять токсинотипов (A-E) на основе присутствия четырех различных генов токсина: альфа, бета, эпсилон, и йота токсина (Таблица 1)1. Недавно было высказано предположение, что эта схема ввода должна быть расширена, чтобы включить типы F и G, которые гавани C. perfringens энтеротоксин (CPE) и NetB токсин, соответственно2. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования, прежде чем эта система интриг будет официально принята. В то время как ген альфа-токсина строго хромосомно расположен, ген CPE можно найти как на хромосоме, так и на плазмидах. Для сравнения, оставшиеся гены токсинов встречаются на различных плазмидах разного размера. Мы особенно заинтересованы в распространенности C. perfringens типов B и D, как эти штаммы производят эпсилон токсин, чрезвычайно мощный, пор-образующий токсин, который был предложен, чтобы играть роль в запуске рассеянного склероза (МС) у людей3 ,4,5,6,7. Как люди заражаются или колонизированы этими штаммами неизвестно. Одним из возможных объяснений является потребление зараженных пищевых продуктов. Чтобы помочь ответить на этот вопрос, мы стремились определить распространенность различных C. perfringens токсинотипов в американских образцах продуктов питания.
Присутствие C. perfringens токсинотипов в американских образцах продуктов питания недостаточно изучено и часто требует использования анаэробных контейнерных систем и многочисленных подкультивных шагов8,9,10,11 . Хотя многочисленные подкультивные шаги необходимы для получения очищенных изолятов, этот метод может привести к потере плазмидов с течением времени12,13,14, возможно, влияющих на обнаружение плазмидных генов токсина включая ген эпсилона токсина. Мы стремились разработать простой метод, с меньшим количеством подкультивных шагов, чтобы выборочно культуры C. perfringens без использования анаэробных камер, банки, или мешки. Кратко, образцы еды привиты в быстрое Perfringens медиа (RPM) всю ночь (ON), после этого «зажаты» в агар TSC и инкубированные ON. Колонии, подозреваемые в C. perfringens затем суб-культуры в RPM и инкубации снова ON. ДНК извлекается и ПЦР выполняется для определения генотипа(Рисунок 1). Мы решили использовать RPM, как было продемонстрировано, чтобы увеличить восстановление штаммов C. perfringens из образцов продуктов питания по сравнению с другими более стандартными носителями15. Кроме того, RPM был успешно использован для изоляции эпсилона токсина производства штамма типа В от пациента MS4. Мы используем модифицированную версию RPM вместо оригинальной версии, чтобы легко экстракции ДНК. Хотя этот метод позволяет легко идентифицировать гены токсинов в образцах, вполне возможно, что отдельный образец будет содержать более одного C. perfringens токсинотипа. Поскольку наш метод не изолирует очищенные штаммы с помощью нескольких раундов очистки, идентификация нескольких токсинотипов из одного образца невозможна. Тем не менее, стандартные методы очистки (как правило, полос на TSC пластин ы или крови агар пластин) могут быть применены в конце нашего протокола для достижения очищенных культур.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем метод выявления распространенности C. perfringens в розничных образцах продуктов питания с ограниченным субкультивированием и без использования анаэробной камерной системы. Этот метод использует комбинацию методов для увеличения идентификации C. perfringens из образцов пищевых продуктов. Используя модифицированную версию носителей RPM, мы допускаем селективный рост C. perfringens. Путем зажав привитых RPM между слоями Агар TSC, мы можем определить и изолировать анаэробные, сульфит-снижающие бактерии, характерные для C. perfringens. Для подтверждения наличия C. perfringens,сульфит-снижающие колонии суб-культурны в свежие RPM. Модифицированная версия или RPM позволяет нам легко извлечь ДНК из культур, что позволяет ПЦР подтверждение конкретных генов токсина. Подтверждение C. perfringens загрязненных образцов пищевых продуктов может быть достигнуто в течение трех дней.
В ранних экспериментах образцы пищи были просто привиты в RPM и ДНК, извлеченные из ON культур. Этот метод привел к обнаружению C. perfringens в ограниченном числе образцов (данные не показаны). Хотя RPM является избирательным для роста C. perfringens, он не является эксклюзивным для роста C. perfringens. Другие, грамположительные, D-циклсерин устойчивые бактерии все еще могут расти в RPM. Мы предположили, что загрязнение другими бактериальными видами, возможно, уменьшило наше обнаружение штаммов C. perfringens за счет снижения чувствительности нашего анализа ПЦР в нашей первой культуре ON RPM. Важным шагом в увеличении обнаружения C. perfringens было включение tSC агар “сэндвич” техники. Это позволило нам дифференцировать и выбрать для анаэробных, сульфит-снижающих колоний, характерных для C. perfringens. Ключевым шагом в этом процессе является обеспечение того, чтобы верхний слой расплавленного агара TSC находится на уровне 40 градусов по Цельсию. Хотя некоторые штаммы C. perfringens могут расти при повышенной температуре (46-48 градусов по Цельсию)15,16, добавление расплавленного агара при повышенной температуре значительно снижает количество восстановленных культур, в основном, вероятно, из-за смерти клеток .
Существует несколько потенциальных ограничений для этого метода. Как упоминалось ранее, ни RPM, ни TSC агар выбирает или дифференцирует для C. perfringens исключительно, что позволяет для роста других видов бактерий, присутствующих в образцах продуктов питания. Это может снизить чувствительность ассса, чтобы выбрать только для C. perfringens. Тем не менее, это общее ограничение почти во всех методах культивирования. Генотипирование подтверждение очищенных изолятов является лучшим методом для окончательной идентификации C. perfringens и других видов бактерий. Еще одним ограничением этого исследования является то, что мы не тестируем очищенные изоляты. Мы специально сделали это, чтобы ограничить количество субкультивации, так как повторное субкультирование, как опасаются, приведет к потере плазмида. Поскольку мы не изолируем чистоту, вполне возможно, что несколько C. perfringens токсинотипов могут присутствовать в том же образце или субкультуры. Если исследователи хотят получить очищенные изоляты, стандартные методы очистки могут быть использованы на последней культуре RPM, описанной в этом методе; это обычно требует использования анаэробных камер. Хотя первоначально используется для изоляции C. perfringens от пищи, этот метод может быть использован для выявления и изоляции C. perfringens из множества источников. В частности, одним из таких применений этого метода является тестирование фекальных образцов от людей (или животных), которые, как предполагается, инфицированы C. perfringens и токсинотипа бактерий, чтобы лучше понять источник инфекции.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование не получило какого-либо конкретного финансирования со стороны государственного, коммерческого или некоммерческого секторов.
Materials
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O’Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
