إثراء والكشف عن الأنماط التوكستريديوم بيرفرينجنز في عينات أغذيه التجزئة
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن مختلف أنواع التوكستريديوم بيرفرينجنز السمية في الاطعمه المشترية محليا ، ولا سيما السموم ابسيلون إنتاج سلاله نوعين B و D ، دون استخدام الغرف لاهوائية.
Abstract
كلوستريديوم بيرفرينجنز (c. بيرفرينجنز) هو منتج السموم غزير ويسبب مجموعه واسعه من الامراض في المضيفين المختلفة. C. بيرفرينجنز يتم تصنيفها إلى خمسه أنواع سميه مختلفه ، من A إلى E ، استنادا إلى نقل أربعه الجينات السامة الرئيسية. وقد تمت دراسة مدي انتشار وتوزيع هذه الأنواع المختلفة من السموم ، ولا سيما في الاغذيه الامريكيه بالتجزئة. ومن الاهميه بمكان بالنسبة لنا هو نوع B و D سلالات ، والتي تنتج السموم ابسيلون ، والسموم القاتلة للغاية واقترح ان يكون الزناد البيئي لتصلب متعددة في البشر. لتقييم وجود أنواع مختلفه من السميات c. بيرفرينجنز في عينات الطعام المختلفة ، وضعنا طريقه سهله لثقافة انتقائية هذه البكتيريا دون استخدام نظام الحاويات لاهوائية فقط التي تنطوي علي ثلاث خطوات الذبح. يتم شراء الاغذيه من محلات البقالة المحلية ونقلها إلى المختبر في ظل الظروف المحيطة. يتم فرم العينات وتطعيمها في وسائط بيرفرينجنز السريعة المعدلة (RPM) ويتم احتضانها بين عشيه وضحيها عند 37 درجه مئوية في أنبوب مخروطي محكم الغلق. يتم تطعيم الثقافات بين عشيه وضحيها علي طبقه سفليه من الصلبة Tryptose سلفايت السيكلوسبورين (المستوي التدريبي) أجار ، ومن ثم مضافه مع الطبقة العليا من أجار السائل المنصهر ، وخلق “محصورة” ، والبيئة لاهوائية. يتم احتضان لوحات أجار بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية ومن ثم تقييمها لظهور الأسود ، المستعمرات الحد من الكبريت. C. بيرفرينجنز-يتم أزاله المستعمرات المشتبه بها من أجار الدورة التدريبية باستخدام القطرات العين معقمه ، وتطعيمها في RPM وشبه مثقف بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية في أنبوب مخروطي محكم. يتم استخراج الحمض النووي من الثقافة الفرعية RPM ، ومن ثم تحليلها لوجود الجينات السموم c. بيرفرينجنز عن طريق تفاعل البلمره سلسله (PCR). اعتمادا علي نوع من المواد الغذائية العينات ، عاده 15-20 ٪ من العينات اختبار ايجابيه ل c. بيرفرينجنز.
Introduction
كلوستريديوم بيرفرينجنز (c. بيرفرينجنز) هو غرام إيجابي ، لاهوائية ، بوغ تشكيل ، قضيب علي شكل بكتيريا التي تم العثور عليها في البيئة. هذا النوع من البكتيريا يحمل الجينات التي ترميز لأكثر من 17 السموم ، وتاريخيا ، وقد وصفت في خمسه أنماط السمية (A-E) علي أساس وجود أربعه الجينات السامة المختلفة: الفا ، بيتا ، ابسيلون ، والسموم ذره (الجدول 1)1. في الاونه الاخيره ، وقد اقترح ان هذا المخطط الطباعة يحتاج إلى توسيع لتشمل أنواع F و G ، التي تؤوي السموم المعوية (CPE) و netb السمية ، علي التوالي2. ومع ذلك ، هناك حاجه إلى المزيد من البحوث قبل ان يتم قبول هذا النظام مكيدة رسميا. في حين ان الجينات السامة الفا كروموسوميا يقع بدقه ، يمكن العثور علي الجينات CPE علي حد سواء علي الكروموسوم والبلازميدات. المقارنة ، توجد جينات السموم المتبقية علي مختلف أنواع البلازميدات. ونحن مهتمون بشكل خاص في انتشار c. بيرفرينجنز أنواع B و D لان هذه السلالات تنتج السموم ابسيلون ، وهي قويه للغاية ، والسموم تشكيل المسام ، والتي اقترحت للعب دور في التسبب في التصلب المتعدد (MS) في البشر3 ،4،5،6،7. كيف يصاب الناس أو استعمرت من قبل هذه السلالات غير معروف. ويتمثل أحد التفسيرات الممكنة في استهلاك المنتجات الغذائية الملوثة. للمساعدة في الاجابه علي هذا السؤال ، سعينا لتحديد مدي انتشار مختلف الأنماط السمية في c. بيرفرينجنز في عينات الاغذيه الامريكيه.
وجود السميات السامة بيرفرينجنز في عينات الاغذيه الامريكيه غير مدروس وغالبا ما يتطلب استخدام أنظمه الحاويات لاهوائية والعديد من الخطوات الفرعية8،9،10،11 . علي الرغم من ان هناك حاجه إلى العديد من الخطوات الفرعية للحصول علي العزلات المنقية ، يمكن ان يؤدي هذا الأسلوب إلى فقدان البلازميدات علي مر الزمن12،13،14، ربما تؤثر علي الكشف عن الجينات السمية المنقولة plasmid بما في ذلك الجينات السامة ابسيلون. سعينا إلى تطوير طريقه سهله ، مع عدد اقل من الخطوات الفرعية ، للثقافة انتقائية c. بيرفرينجنز دون استخدام الغرف لاهوائية ، والجرار ، أو أكياس. لفتره وجيزة ، يتم تطعيم عينات الطعام إلى السريع Perfringens وسائل الاعلام (RPM) بين عشيه وضحيها (ON) ، ثم “تقع” في أجار الدورة التدريبية واحتضانها علي. مستعمرات يشتبه ان يكون [ ك.]. [برفريجنز ] بعد ذلك [سوب-بروجنتد] داخل [ربم] وحضنت ثانيه فوق. يتم استخراج الحمض النووي واجراء PCR لتحديد النمط الجيني (الشكل 1). اخترنا لاستخدام دوره في الدقيقة كما ثبت لزيادة الانتعاش من سلالات c. بيرفرينجنز من عينات الغذاء بالمقارنة مع غيرها من وسائل الاعلام القياسية أكثر15. الاضافه إلى ذلك ، تم استخدام RPM بنجاح لعزل السموم ابسيلون إنتاج سلاله من نوع B من المريض MS4. نحن نستخدم نسخه معدله من RPM بدلا من النسخة الاصليه للسماح سهله استخراج الحمض النووي. في حين ان هذا الأسلوب يسمح بسهوله تحديد الجينات السامة داخل العينات ، فمن الممكن ان عينه فرديه سوف تحتوي علي أكثر من واحد c. بيرفرينجنز النمط السام. لان طريقتنا لا تعزل السلالات المنقية باستخدام عده جولات من التنقية ، فان تحديد الأنواع المتعددة من السموم من عينه واحده غير ممكن. ومع ذلك ، يمكن تطبيق تقنيات التنقية القياسية (عاده ما يتم وضعها علي لوحات النظام التدريبي أو لوحات أجار الدم) في نهاية بروتوكولنا لتحقيق الثقافات المنقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن وصف طريقه لتحديد c. بيرفرينجنز انتشار في عينات الاغذيه التجزئة مع الخياطة المحدودة ودون استخدام نظام الغرفة لاهوائية. يستخدم هذا الأسلوب مجموعه من التقنيات لزيادة التعرف علي c. بيرفرينجنز من عينات الطعام. باستخدام نسخه معدله من وسائل الاعلام RPM ، ونحن نسمح للنمو الانتقائي لل c. بيرفرينجنز. بواسطة يقحم دوره في الدقيقة تطعيم بين طبقات أجار المستوي التدريبي ، ونحن قادرون علي تحديد وعزل لاهوائية ، البكتيريا التي تقلل من الكبريت مميزه من c. بيرفرينجنز. لتاكيد وجود c. بيرفرينجنز، والمستعمرات الحد من الكبريت الفرعية إلى دوره في الدقيقة الطازجة. النسخة المعدلة أو RPM يسمح لنا بسهوله استخراج الحمض النووي من الثقافات ، وتمكين PCR تاكيد الجينات السمية محدده. تاكيد c. بيرفرينجنز عينات الاغذيه الملوثة يمكن ان يتحقق في غضون ثلاثه أيام.
في التجارب المبكرة ، تم تطعيم عينات الطعام ببساطه في دوره في الدقيقة والحمض النووي المستخرج من ثقافات ON. ادي هذا الأسلوب في الكشف عن c. بيرفرينجنز في عدد محدود من العينات (البيانات غير معروضه). علي الرغم من ان دوره في الدقيقة انتقائية ل c. بيرفرينجنز النمو ، فانه ليس حصريا ل c. بيرفرينجنز النمو. أخرى, ايجابيه الجرام, D-cycolserine البكتيريا المقاومة يمكن ان تنمو لا تزال في دوره في الدقيقة. افترضنا ان التلوث من الأنواع البكتيرية الأخرى قد انخفضت لدينا الكشف عن سلالات c. بيرفرينجنز من خلال تقليل حساسية تحليل PCR لدينا في الثقافة الاولي علي دوره في الدقيقة. وكان من الخطوات الحاسمة في زيادة الكشف عن c. بيرفرينجنز ادراج تقنيه أجار “ساندويتش” التدريبية. وقد سمح لنا هذا بالتفريق وتحديد المستعمرات لاهوائية التي تقلل من الكبريت ، والمميزة لل c. perfringens. ومن الخطوات الرئيسية في هذه العملية ضمان ان الطبقة العليا من أجار السائل المنصهر هو في 40 درجه مئوية. علي الرغم من ان بعض السلالات c. بيرفرينجنز يمكن ان تنمو في زيادة درجات الحرارة (46-48 °c)15,16, أضافه أجار المنصهر في زيادة درجات الحرارة يقلل كثيرا من كميه الثقافات المستردة, غالبا ما يكون بسبب وفاه الخلية .
هناك العديد من القيود المحتملة علي هذا الأسلوب. كما ذكر سابقا ، لا الدورة التدريبية في الدقيقة ولا النوع أجار يختار أو يميز ل c. بيرفرينجنز حصرا ، مما يسمح للنمو الأنواع البكتيرية الأخرى الموجودة في عينات الغذاء. وهذا قد يقلل من حساسية الفحص لتحديد ل c. بيرفرينجنز فقط. ومع ذلك ، فان هذا هو القيد الشائع في جميع تقنيات الاستزراع تقريبا. تاكيد التنميط الجيني من العزلات المنقية هو أفضل طريقه لتحديد نهائيا c. بيرفرينجنز والأنواع البكتيرية الأخرى. ومن القيود الأخرى التي تحد من هذه الدراسة اننا لا نختبر العزلات المنقية. فعلنا ذلك عمدا للحد من كميه الخياطة ، كما يخشى المتكررة التي تؤدي إلى فقدان البلازميد. لأننا لا عزل إلى النقاء ، فمن الممكن ان متعددة c. بيرفرينجنز الأنماط السمية قد تكون موجودة في نفس العينة أو الثقافة الفرعية. إذا كان الباحثون يرغبون في الحصول علي العزلات المنقية ، يمكن استخدام أساليب التنقية القياسية علي ثقافة RPM الاخيره الموصوفة في هذه الطريقة. وهذا يتطلب عاده استخدام الغرف لاهوائية. علي الرغم من ان تستخدم في الأصل لعزل c. بيرفرينجنز من الغذاء ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد وعزل c. بيرفرينجنز من العديد من المصادر. علي وجه التحديد ، واحد مثل هذا التطبيق من هذا الأسلوب هو لاختبار عينات البراز من البشر (أو الحيوانية) التي يشتبه في انها مصابه مع c. بيرفرينجنز والنمط السام للبكتيريا لفهم أفضل لمصدر العدوى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ولم يتلق هذا البحث اي تمويل محدد من القطاعات العامة أو التجارية أو غير الربحية.
Materials
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O’Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
