小売食品サンプルにおけるクロストリジウム・パーフリンゲントキシノタイプの濃縮と検出

注:C.パーフリンゲンは、バイオセーフティハザードレベル2(BSL2)生物と考えられています。すべての食品サンプルにC.パーフリンゲンが含まれるわけではありませんが、培養されたすべてのサンプルはそのように扱われるべきです。すべての適切な予防措置と人員保護装置(PPE)は常に着用する必要があります。廃棄前にすべての材料を除染してください。 1. 修正されたRPM4、15を準備する 30g/L流体チオ糖化培地、60g/Lゼラチン、5g/Lペプトン、5g/Lグルコース、5g/Lリン酸カリウムジビ塩、3g/L酵母エキス、1.5g/L塩化ナトリウム、0.5g/Lの硫酸性硫酸を脱イオン水中に分散するまで組み合わせます。通常、1 L バッチを作成します。 オートクレーブ 121 °C で 15 分間。 約40°Cまで冷却させて下さい。 RPMが冷めたら、440 mg/Lの最終濃度にD-シクロセリンを加えます。注:50mg/mLで無菌水に溶解したD-シクロセリンのストック濃度は、将来の使用のために-20°Cで保存することができる。 無菌的に15 mL円錐形の管にRPMの10 mLを移す。RPMはバッチで調製でき、最大1ヶ月間4°Cで保存できます。 使用前にRPMを37°Cに暖める。 2. サンプル収集とRPMインキュベーション 1時間以内に周囲温度下で実験室に食品を輸送する食品は、元の包装または滅菌容器で輸送されてもよい。直ちに試験しない場合は、使用するまで-20°Cで保存してもよい。食品の種類と原産国を、パッケージラベル(利用可能な場合)、およびその他の関連情報に従って書き留めます。 約1.0~2.0gの食品を取り出し、無菌ペトリ皿または同等物に移します。無菌のかみそり刃またはメスで細かくミンチ。 15 mL円錐管内のリン酸緩衝生理食液(PBS)の10mLに接種する。よく混ぜる。 栄養細胞を選択するには、PBS-食品混合物の5 mLをRPMの10 mLを含む15 mL円錐管に移します。蓋をしっかりと固定します。 胞子を選択するには、残りの5mLのPBS-Food混合物を85°Cで15分間加熱し、10mLのRPMを含む15 mLの円錐管に移します。蓋をしっかりと固定します。 渦と完全な混合を確保するために食品-RPM培養物を反転します。 円錐形のチューブをしっかりと密閉し、蓋をパラフィンフィルムまたはプラスチックラップで包み、嫌気性環境を確保します。 37 °Cで一晩(ON)インキュベートします。 次の朝は、RPMチューブの濁りや発酵に注意してください。 3. TSC 「サンドイッチ」メッキ 以下に説明する「サンドイッチ」技術(図2)を用いて、On RPM培養物をTSC寒天に接種する。 製造元の指示に従って、TSC 寒天を準備します。 溶融TSC寒天の10 mLを滅菌ペトリ皿に移してTSCプレートのベース層を準備し、固化させます。これらは、高度に調製し、4°Cで保存することができる。使用前にプレートを室温に温めます。 TSCプレートの最上層については、残りの溶融TSC寒天を40°Cで維持します。注:寒天の融点は85°Cを超えますが、溶融寒天は32~45°Cの周りに固化します。 ON RPM培養物を慎重に取り出し、100 μLをTSC寒天ベースに移します。発酵のため、一部の培養物が圧力を受けている可能性があります。すべての適切なPPEを着用してください。 殺菌ガラスビーズまたは細胞拡散機を使用してRPMイノクルを広げる。 RPMを室温で5~10分間TSC寒天に「吸収」できるようにします。 慎重に溶融の20 mL、40 °C TSC寒天を血清ピペットを使用してプレートに移します。 ペトリ皿のふたを交換し、TSC寒天が室温で完全に固化できるようにします。 ペトリ皿を反転し、37 °C ONでインキュベートします。 シリアル希釈が望ましい場合は、TSC寒天に接種する前に、オンRPM培養物を新鮮で予め温められたRPMに希釈を行います。 4. 亜硫酸還元コロニーのサブ培養 翌朝、インキュベーターからプレートを取り出し、細菌の増殖を調べる。好気性細菌は寒天の表面に存在してもよい。嫌気性細菌は寒天の中に埋め込まれた成長を見つけるでしょう。亜硫酸還元細菌は寒天を黒く変える。可能なC.パーフリンゲンコロニーは黒色になり、寒天に埋め込まれます。 C.パーフリンゲンは、コロニーが亜硫酸塩の減少のために陽性になり、寒天の中に埋め込まれた黒く見えます。無菌の単一使用のスポイトを使用して、寒天から黒いコロニーを「摘み取り」し、15 mL円錐管で新鮮なRPMの10 mLに移します。寒天を突き刺す前に、スポイトからの空気を排出することが重要です。 プレートの表面に有酸素細菌の増殖量が多い場合は、滅菌細胞スクレーパーを使用して、選択した領域からコロニーを除去します。コロニーの疑いがある複数のC.パーフリンゲンは、同じTSCプレートから別々のRPM培養物にサンプリングすることができる。 しっかりと固定円錐形のチューブの蓋とパラフィンフィルムやラップでラップします。37 °Cでオンにインキュベートします。 5. DNA抽出 ON RPM培養物を除去し、濁りや発酵を含む成長の兆候を調べます。 RPM培養を穏やかに反転させ、落ち着いた細菌を分散させ、慎重に開きます。培養部の1mLをマイクロ遠心管に移す。 ペレット細菌に10分間の最高速度(約15,000 x g)で遠心分離機。 無菌PBSの1 mLでペレットを洗浄します。 いくつかの状況では、消化されていないゼラチンは、ペレット細菌の上に定着します。ゼラチンを除去するには、マイクロピペットを用いてPBSで穏やかに攪拌することによりゼラチンを「ふくらむ」。これは、細菌ペレットをそのまま残しながら、ゼラチンを「ふくらま」します。 穏やかな吸引でPBS-ゼラチン混合物を除去します。残りの細菌ペレットを1mLの新鮮なPBSで再停止します。 10分間の最高速度で再懸濁した細菌ペレットを遠心分離し、慎重に上清を吸引する。 直ちに、グラム陽性細菌からの抽出DNA用に作成されたDNA抽出キットとプロトコルを用いてDNA抽出を行う(材料の表を参照)。 抽出したDNAを直ちに使用するか、PCR分析まで-20°Cで保存してください。 6. PCRジェノタイピングによるC.パーフリンゲンの検出 培養物がC.パーフリンゲン毒素型に陽性であるかどうかを判断するには、抽出されたDNAをPCRを介して異なる毒素遺伝子について調べる。注:我々は、B型およびD C.パーフリンゲン型のイプシロン毒素産生株に最も興味を持っているので、我々は、α、ベータ、およびイプシロン毒素遺伝子の存在を評価する。プライマーは表2に記載されています。16sリボソームDNAのプライマーは、DNA抽出制御として使用されます。追加のプライマーは、Gを介してトキシノタイプAをテストするために使用することができ、出版文献2、12、13で見つけることができます。 以前に抽出されたC.パーフリンゲンDNAを陽性対照として使用する。この制御は、PCR反応のすべてのコンポーネントが動作していることを保証します。C.パーフリンゲンスB型(ATCC 3626)から抽出したDNAを陽性対照として使用しています。37°CでRPMでATCC 3636 ONを成長させ、ステップ5.1〜5.7で説明したのと同じ方法を使用してDNAを抽出します。抽出したDNAを使用するまで-20°Cで保存します。 PCR条件を次のように設定する: 94.0 °C 3 分;94.0 °C 30 s;47.9 °C 30 s、 72.0 °C 1 分間 (35 サイクルで 2 ~4 回繰り返し手順を繰り返す)72.0 °C 10分 PCR製品を確認するには、標準的な技術を使用して1.8 g/100 mLのアガロースゲルでPCR反応を実行します。予想される PCR 製品サイズは、表 2に示されています。一般的な PCR 結果は図 3に表示されます。