Enriquecimiento y detección de toxinatipos de Clostridium perfringens en muestras de alimentos al por menor

NOTA: C. perfringens se considera un organismo de nivel de riesgo de bioseguridad 2 (BSL2). Aunque no todas las muestras de alimentos contendrán C. perfringens, todas las muestras cultivadas deben tratarse como tales. Todas las precauciones adecuadas y el equipo de protección del personal (PPE) deben ser usados en todo momento. Descontaminar todo el material antes de la eliminación. 1. Preparar RPMmodificadas 4,15 Combinar 30 g/L de tioglicolato líquido medio, gelatina de 60 g/L, peptona de 5 g/L, glucosa de 5 g/L, fosfato de potasio de 5 g/L dibásico, extracto de levadura de 3 g/L, cloruro sódico de 1,5 g/L, sulfato ferroso de 0,5 g/L en agua desionizada hasta que se disperse uniformemente. Normalmente hacemos 1 L lotes. Autoclave a 121oC durante 15 min. Dejar enfriar a aproximadamente 40 oC. Una vez que RPM esté fría, añadir D-cicloserina a una concentración final de 440 mg/L.NOTA: Las concentraciones de stock de D-cicloserina disuelta en agua estéril a 50 mg/ml pueden almacenarse a -20 oC para su uso futuro. Transferencia aséptica de 10 ml de RPM a tubos cónicos de 15 ml. Rpm se puede preparar en lotes y almacenar a 4 oC durante un mes. RPM cálidas a 37 oC antes de su uso. 2. Recolección de muestras e incubación de RPM Transportar los alimentos al laboratorio a temperatura ambiente dentro de 1 h. Los alimentos pueden transportarse en envases originales o en recipientes estériles. Si no se prueba inmediatamente, los alimentos pueden almacenarse a -20 oC hasta su uso. Tome nota del tipo de alimento y del país de origen de acuerdo con la etiqueta del envase, si está disponible, así como cualquier otra información relevante. Retire aproximadamente 1.0–2.0 g de alimentos y transfiera a un plato estéril de Petri o equivalente. Picar finamente con una cuchilla de afeitar estéril o bisturí. Inocular en 10 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) en un tubo cónico de 15 ml. Mezcla bien. Para seleccionar células vegetativas, transfiera 5 ml de la mezcla PBS-food a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPM. Fije bien la tapa. Para seleccionar esporas, calentar los 5 ml restantes de la mezcla de ALIMENTOs PBS a 85 oC durante 15 minutos y, a continuación, transferir a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPM. Fije bien la tapa. Vórtice e invierta los cultivos alimentarios-RPM para asegurar una mezcla completa. Selle bien los tubos cónicos y envuelva las tapas con película de parafina o envoltura de plástico para garantizar un ambiente anaeróbico. Incubar durante la noche (ON) a 37oC. A la mañana siguiente tenga en cuenta cualquier turbidez o fermentación en tubos RPM. 3. Revestimiento “sándwich” TSC Inocular los cultivos de RPM en el agar TSC utilizando una técnica de “sándwich”(Figura 2) que se describe a continuación. Prepare el agar TSC según las instrucciones del fabricante. Preparar la capa base de las placas TSC transfiriendo 10 ml de agar TSC fundido a platos estériles de Petri y dejar solidificar. Estos pueden ser preparados de forma avanzada y almacenados a 4 oC. Asegúrese de que las placas estén calentadas a temperatura ambiente antes de su uso. Para la capa superior de la placa TSC, mantenga el agar TSC fundido restante a 40 oC.NOTA: Aunque el punto de fusión del agar está por encima de 85 oC, el agar fundido solidifica entre 32 y 45 oC. Recupere cuidadosamente los cultivos DE RPM ON y transfiera 100 l a la base de agar TSC. Debido a la fermentación, algunos cultivos pueden estar bajo presión. Asegúrese de usar todos los EPP apropiados. Extienda el inóculo de RPM con cuentas de vidrio esterilizadas o esparcidor celular. Deje que las RPM se “absorban” en el agar TSC durante 5-10 min a temperatura ambiente. Transfiera cuidadosamente 20 ml de agar TSC fundido a 40 oC a placa utilizando una pipeta serológica. Sustituya la tapa de la placa Petri y deje que el agar TSC se solidifique completamente a temperatura ambiente. Invertir la placa Petri e incubar a 37oC ON. Si se desean diluciones en serie, realice diluciones de los cultivos ON RPM en RPM frescas y precalentadas antes de la inoculación en el agar TSC. 4. Subcultivo de colonias reductoras de sulfito A la mañana siguiente, retire las placas de la incubadora y examine el crecimiento bacteriano. Las bacterias aeróbicas pueden estar presentes en la superficie del agar. Las bacterias anaeróbicas se encontrarán creciendo incrustadas dentro del agar. Las bacterias que reducen el sulfito se volverán negras para el agar circundante. Las posibles colonias de C. perfringens serán negras e incrustadas en el agar. C. perfringens colonias sospechosas serán positivas para la reducción de sulfito y aparecerán negro, incrustado dentro del agar. Usando un cuentagotas estéril de un solo uso, “pluck” las colonias negras del agar y transferir a 10 mL de RPM frescas en un tubo cónico de 15 ml. Es importante que el aire del cuentagotas sea expulsado antes del agar penetrante. Si hay una densa cantidad de crecimiento bacteriano aeróbico en la superficie de la placa, utilice un rascador de células estériles para eliminar las colonias de las áreas seleccionadas. Múltiples Colonias sospechosas de C. perfringens se pueden muestrear desde la misma placa TSC en cultivos de RPM separados. Fije firmemente las tapas cónicas del tubo y envuélvalas en película de parafina o envoltura de plástico. Incubar ON a 37oC. 5. Extracción de ADN Retire los cultivos de RPM y examine los signos de crecimiento, incluida la turbidez y la fermentación. Invierta suavemente el cultivo de RPM para dispersar cualquier bacteria asentada y abrir cuidadosamente. Transfiera 1 ml del cultivo a un tubo de microcentrífuga. Centrífuga a máxima velocidad (aproximadamente 15.000 x g)durante 10 minutos a las bacterias pellets. Lavar el pellet con 1 ml de PBS estéril. En algunas circunstancias, la gelatina no digerida se asentará sobre bacterias peletizadas. Para eliminar la gelatina, “fluff” de la gelatina agitando suavemente con PBS usando un micropités. Esto “fluff-up” la gelatina mientras que deja el pellet bacteriano intacto. Retire la mezcla DE PBS-gelatina con una aspiración suave. Vuelva a suspender el pellet bacteriano restante con 1 ml de PBS fresco. Centrifugar el pellet bacteriano resuspendido a máxima velocidad durante 10 minutos y aspirar cuidadosamente al sobrenadante. Realizar inmediatamente la extracción de ADN utilizando un kit de extracción de ADN y un protocolo creado específicamente para la extracción de ADN de bacterias Gram-positivas (ver la Tabla de Materiales). Utilice el ADN extraído inmediatamente o guárdelo a -20 oC hasta el análisis de PCR. 6. Detección de C. perfringens a través del genotipado de PCR Para determinar si los cultivos son positivos para los toxinas c. perfringens, examine el ADN extraído para diferentes genes de toxinas a través de PCR.NOTA: Debido a que estamos más interesados en la toxina de épsilon que produce cepas tipo B y D C. perfringens, evaluamos la presencia de los genes de toxina alfa, beta y épsilon. Los primers se enumeran en la Tabla 2. Los imprimadores para ADN ribosomal de 16s se utilizan como control de extracción de ADN. Se pueden utilizar imprimaciones adicionales para probar los toxinatipos A a G y se pueden encontrar en la literatura publicada2,12,13. Utilice el ADN de C. perfringens extraído previamente como un control positivo. Este control garantiza que todos los componentes de las reacciones PCR estén funcionando. Utilizamos ADN extraído de C. perfringens tipo B (ATCC 3626) como nuestro control positivo. Crecer ATCC 3636 ON en RPM a 37 oC y extraer ADN utilizando los mismos métodos descritos en los pasos 5.1–5.7. Almacenar el ADN extraído a -20 oC hasta su uso. Establecer las condiciones de PCR de la siguiente manera: 94,0 oC durante 3 min; 94,0 oC para 30 s; 47,9 oC para 30 s, 72,0 oC durante 1 min (repetir los pasos 2–4 para 35 ciclos); 72,0 oC durante 10 min. Para confirmar los productos de PCR, ejecute reacciones de PCR en un gel de agarosa de 1,8 g/100 ml utilizando técnicas estándar. Los tamaños de producto de PCR esperados se enumeran en la Tabla 2. Los resultados típicos de LA PCR se muestran en la Figura 3.