העשרה ואיתור הפרסטרידיום של רעלים בדגימות מזון קמעונאי
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות שונים Clostridium הפרסטריגנים טוקנוסוגים של מזון מקומי נרכש, במיוחד אפסילון רעלן ייצור סוגי זן B ו-D, ללא שימוש בתאי אנאירובית.
Abstract
קלוסטרידיום פרפיגנס (ג. פרפיגנס) הוא מפיק רעלים פורה וגורם למגוון רחב של מחלות במארחים שונים. ג. פרהגנס מסווג לחמישה רעלים שונים, A דרך E, מבוסס על כרכרה של ארבעה גנים הרעלן העיקריים. השכיחות וההפצה של הרעלים השונים הללו הם בעלי לימודים שונים, במיוחד הpervasiveness שלהם במזון הקמעונאי האמריקאי. עניין מיוחד לנו הם הסוג B ו-D זנים, אשר מייצרים אפסילון רעלן, רעלן קטלני ביותר הציע להיות הגורם הסביבתי של טרשת נפוצה בבני אדם. כדי להעריך את הנוכחות של C. pergens רעלים שונים בדגימות מזון שונים, פיתחנו שיטה קלה באופן סלקטיבי תרבות חיידקים אלה ללא שימוש במערכת מכולה אנאירובית רק מעורבים שלושה צעדים culturing. מזון נרכש מחנויות מכולת מקומיות ומועבר למעבדה בתנאי הסביבה. דגימות הם כתוש ומחוסן לתוך שונה מדיה הפרטוגנים מהירה (RPM) ו מודבטים לילה ב 37 ° c בצינור אטום, אטום חרוט. תרבויות לילה מחוסנת על שכבה תחתונה של טריקטוז סולפיט ציקלוסרין (TSC) אגר, ולאחר מכן מצופה בשכבה העליונה של מותכת TSC אגר, יצירת סביבה “דחוקה”, אנאירובית. לוחות אגר מודבטים לילה ב 37 ° c ולאחר מכן מוערך עבור המראה של שחור, סולפיט להפחתת המושבות. ג. הפרטוגנים-מושבות החשודות מוסרות מ-tsc אגר באמצעות מדרומי עיניים סטריליים, ומחוסן לתוך RPM ו-sub-תרבותי לילה ב 37 ° c בצינור אטום חרוט. ה-DNA מופק מתוך תת-תרבות RPM, ולאחר מכן ניתח עבור נוכחות של C. הפרשגנים הרעלן באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). בהתאם לסוג המזון שנדגם, בדרך כלל 15-20% של דגימות מבחן חיובי עבור C. פרשגנס.
Introduction
קלוסטרידיום פרצגנס (ג. פרצגנס) הוא גראם חיובי, אנאירובי, יוצר נבג, חיידק בצורת מוט שנמצא אוביקוויטיבי בסביבה. זן זה של חיידקים נושאת גנים המקודדים במשך מעל 17 רעלים, היסטורית, התאפיין בחמישה רעלים (A-E) מבוסס על נוכחות של ארבעה גנים הרעלן שונים: אלפא, בטא, אפסילון, ו הרעלן איודה (שולחן 1)1. לאחרונה, הוצע כי זו ערכת הקלדה צריך להתרחב כדי לכלול את הסוגים F ו-G, אשר הנמל C. pergens בידור (cpe) ו-netb הרעלן, בהתאמה2. עם זאת, נדרש מחקר נוסף לפני מערכת זו מזימות מקובלת רשמית. בעוד גן אלפא רעלן הוא בהחלט ממוקם כרומוסומלית, הגן CPE ניתן למצוא הן על כרומוזום ו פלמידים. לעומת זאת, הגנים הנותרים של הרעלים מצויים בפלמידים שונים בגודל שונה. אנו מעוניינים במיוחד בשכיחות של C. pergens סוגים B ו D כמו זנים אלה לייצר אפסילון רעלן, חזק מאוד, הנקבוביות להרכיב רעלן, אשר הוצע לשחק תפקיד מפעילה טרשת נפוצה (MS) בבני אדם3 ,4,5,6,7. כיצד אנשים הופכים נגועים או הכובש על ידי זנים אלה אינו ידוע. הסבר אפשרי אחד הוא באמצעות צריכת מוצרי מזון מזוהמים. כדי לעזור לענות על שאלה זו, ביקשו לקבוע את השכיחות של שונים של C. הפרגנים רעלים בדגימות המזון האמריקאי.
הנוכחות של C. pergens רעלים בדגימות המזון האמריקאי הוא למד לעתים קרובות דורש שימוש של מערכות מכולה אנאירובית ושלבים רבים sub-culturing8,9,10,11 . למרות שפעולות sub-culturing רבות נחוצות כדי לקבל מבודד מטוהר, שיטה זו יכולה להוביל לאובדן של פלמידס לאורך זמן12,13,14, ואולי להשפיע על גילוי של גנים רעלן בשלבי המועברות . כולל הגן הרעלן של אפסילון ביקשו לפתח שיטה קלה, עם פחות צעדים תת-שלבי, לתרבות בררנית C. פרפוגנים ללא שימוש בתאים אנאירובית, צנצנות או שקיות. בקצרה, דגימות מזון מחוסנו לתוך מדיה פרטוגנס מהירה (RPM) לילה (ב), אז “דחוקה” לתוך TSC אגר ו מודב. המושבות שנחשדו כאלה הם משני מתורבתים לאחר מכן לתוך סל ד ומודגרות שוב ושוב . ה-DNA מופק ו-PCR המבוצעים כדי לקבוע גנוטיפ (איור 1). בחרנו להשתמש RPM כפי שהוא הוכח כדי להגדיל את ההתאוששות של C. pergens זנים מתוך דגימות מזון לעומת מדיה רגילה אחרים15. בנוסף, RPM השתמשו בהצלחה כדי לבודד את אפסילון מייצר סוג B זן מחולה MS4. אנו משתמשים בגירסה ששונתה של RPM במקום בגירסה המקורית כדי לאפשר חילוץ קל DNA. בעוד שיטה זו מאפשרת זיהוי קל של גנים הרעלן בתוך דגימות, ייתכן שמדגם בודד יכיל יותר C. pergens toxinotype. מכיוון שהשיטה שלנו לא לבודד זנים מטוהרים באמצעות סיבובים מרובים של טיהור, זיהוי של רעלים מרובים מדגם אחד אינו אפשרי. עם זאת, טכניקות טיהור סטנדרטיות (בדרך כלל יורד על צלחות TSC או לוחות דם אגר) ניתן להחיל בסוף הפרוטוקול שלנו כדי להשיג תרבויות מטוהרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה כדי לזהות את השכיחות של C. שכיחות בדגימות מזון קמעונאי עם subculturing מוגבלת, ללא שימוש במערכת קאמרית אנאירובית. שיטה זו משתמשת בשילוב של טכניקות כדי להגביר את הזיהוי של C. פרסוגנים מדגימות מזון. על-ידי שימוש בגירסה ששונתה של מדיית RPM, אנו מאפשרים את התפתחותם הסלקטיבית של C. פרמיגנס. על ידי sandwiching את סל ד מחוסן בין שכבות של TSC אגר, אנחנו מסוגלים לזהות ולבודד אנאירובית, סולפיט הפחתת חיידקים מאפיין של C. פרצוגנים. כדי לאשר את נוכחותו של C. pergens, סולפיט המושבות מושבות הם תת-תרבותית לתוך סל ד טרי. הגרסה ששונתה או RPM מאפשר לנו בקלות לחלץ DNA מתרבויות, המאפשר אישור PCR של גנים הרעלן ספציפיים. אישור לקבלת דגימות מזון מזוהם ניתן להשיג בתוך שלושה ימים.
בניסויים מוקדמים, דגימות מזון היו פשוט מחוסן לתוך RPM ו-DNA שחולצו מן התרבויות. שיטה זו הביאה לגילוי של C. פרסוגנים במספר מצומצם של דגימות (נתונים לא מוצגים). למרות RPM הוא סלקטיבי לצמיחה c. pergens , זה לא בלעדי עבור c. פרמיגנס צמיחה. אחר, גראם חיובי, D-cycolserine חיידקים עמידים עדיין יכול לגדול RPM. אנו שיערו כי זיהום על ידי מינים חיידקים אחרים אולי ירדו הגילוי שלנו של C. pergens זנים על ידי הפחתת רגישות של ניתוח ה-PCR שלנו הראשון שלנו בתרבות RPM. צעד מכריע בהגברת הזיהוי של הטכניקה הייתה הכללה של טכניקת ה סנדוויץ ‘ של tsc אגר. זה איפשר לנו להבדיל ולבחור עבור המושבות אנאירובית, סולפיט הפחתת מושבות, מאפיין של C. פרסגנס. צעד מפתח בתהליך זה הוא להבטיח כי השכבה העליונה של TSC אגר מותכת הוא ב 40 ° c. למרות שזנים של C. pergens יכול לצמוח בטמפרטורות מוגברת (46 – 48 ° c)15,16, תוספת של אגר מותכת בטמפרטורות מוגברת מפחית במידה ניכרת את כמות התרבויות ששוחזרו, בעיקר כנראה בשל מוות התאים .
קיימות מספר מגבלות פוטנציאליות לשיטה זו. כפי שהוזכר קודם לכן, לא RPM או TSC אגר בוחרת או מבדיל עבור C. פרצוגנים באופן בלעדי, המאפשר צמיחה של זנים חיידקיים אחרים להיות בדגימות מזון. זה עשוי להפחית את הרגישות של האפשרות לבחור עבור C. הפרגנים בלבד. עם זאת, זוהי מגבלה נפוצה כמעט כל טכניקות culturing. אימות הגנוזה של מבודד מטוהר הוא השיטה הטובה ביותר לזיהוי בוודאות של C. פרפיגנס ומינים חיידקיים אחרים. מגבלה נוספת של מחקר זה היא כי אנחנו לא לבדוק את הבודד מטוהר. במתכוון עשינו את זה כדי להגביל את כמות subculturing, כמו subculturing חוזרת הוא חשש לגרום הפסד פלמיד. מכיוון שאיננו מבודדים לטוהר, ייתכן כי מספר רב של מרבית הרעלים עלולים להיות נוכחים באותה דוגמית או תת-תרבות. אם החוקרים רוצים לקבל מבודד מטוהרים, שיטות טיהור סטנדרטי ניתן להשתמש בתרבות RPM האחרון שמתואר בשיטה זו; זה דורש בדרך כלל את השימוש של תאים אנאירובית. למרות ששימש במקור לבידוד c. פרסוגנים ממזון, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות ולבודד c. פרסוגנים מהמון מקורות. במיוחד, יישום אחד כזה של שיטה זו היא לבדוק דגימות צואה של בני אדם (או בעלי חיים) כי הם חשודים נגועים עם C. פרצוגנים ורעלים החיידקים כדי להבין טוב יותר את מקור הזיהום.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה לא קיבל שום מימון ספציפי ממגזר הציבורי, המסחרי או לא-למטרות רווח.
Materials
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O’Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
