Summary

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Published: July 17, 2019
doi:

Summary

Aqui, apresentamos uma implementação de MATLAB de detecção automatizada e descrição quantitativa de gotas lipídicas em imagens de microscopia de fluorescência de fissão e brotamento de células de levedura.

Abstract

O metabolismo lipídico e seu regulamento são de interesse para as Ciências da vida básica e aplicada e biotecnologia. A este respeito, várias espécies de leveduras são usadas como modelos na pesquisa metabólica lipídica ou para a produção de lipídios industriais. Gotículas lipídicas são corpos de armazenamento altamente dinâmicos e seu conteúdo celular representa uma leitura conveniente do estado metabólico lipídico. A microscopia de fluorescência é um método de escolha para a análise quantitativa de gotas lipídicas celulares, pois depende de equipamentos amplamente disponíveis e permite a análise de gotas lipídicas individuais. Além disso, a análise de imagem microscópica pode ser automatizada, aumentando consideravelmente a taxa de transferência geral. Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho experimental e analítico para a deteção automatizada e a descrição quantitativa de gotas lipídicas individuais em três espécies modelo diferentes do fermento: as leveduras da fissão Schizosaccharomyces pombe e Schizosaccharomyces japonicus, e o fermento brotamento Saccharomyces cerevisiae. As gotas do lipido são visualizadas com BODIPY 493/503, e o dextrano fluorescente Cell-impermeable é adicionado aos meios de cultura para ajudar a identificar limites da pilha. As células são submetidas à microscopia de epifluorescência 3D em canais verdes e azuis e as imagens de pilha z resultantes são processadas automaticamente por um pipeline MATLAB. O procedimento produz dados quantitativos ricos sobre o conteúdo de gotas lipídicas celulares e características individuais de gotas lipídicas em um formato tabular adequado para análises a jusante em grandes planilhas ou pacotes estatísticos. Nós fornecemos exemplos de análises de conteúdo de gotículo lipídico várias condições que afetam o metabolismo lipídico celular.

Introduction

Os lipídios desempenham papéis cruciais na energia celular e no metabolismo do carbono, na síntese dos componentes da membrana e na produção de substâncias bioativas. O metabolismo lipídico é ajustado de acordo com as condições ambientais, a disponibilidade de nutrientes e a fase1do ciclo celular. Nos seres humanos, o metabolismo lipídico tem sido ligado a doenças, tais como obesidade, diabetes tipo II e câncer2. Na indústria, os lipídios produzidos por microrganismos, como leveduras, representam uma fonte promissora de combustíveis diesel renováveis3. As células armazenam lipídios neutros nas chamadas gotículas lipídicas (LDs). Estes corpos evolutivamente conservados são compostos de triacilgliceróis, ésteres de esterilo, monocamada fosfolipídica externa e proteínas associadas1. Os LDs se originam no retículo endoplasmático, exercem dinâmicas de ciclo celular ou de fase de crescimento e são importantes para a homeostase lipídica celular1. O número e a morfologia do LD podem ser usados como um proxy conveniente ao ensaio o metabolismo do lipido várias condições de crescimento ou ao selecionar um painel dos mutantes. Dada a sua natureza dinâmica, as técnicas capazes de analisar as propriedades dos LDs individuais são de particular interesse em estudos de metabolismo lipídico.

Várias espécies de leveduras têm sido usadas para descrever as vias metabólicas relacionadas a lipídios e sua regulação, ou usadas em biotecnologia para produzir compostos ou combustíveis interessantes1. Além disso, para leveduras modelo, como a levedura brotamento Saccharomyces cerevisiae ou o fermento de fissão distante relacionados Schizosaccharomyces pombe, bibliotecas de deformação de exclusão de todo o genoma estão disponíveis que podem ser usados para alta taxa de transferência telas4,5. Recentemente a composição e a dinâmica do LD foram descritas em S. pombe6, 7,8,9, e os mutantes relativos ao metabolismo lipídico foram isolados no fermento modelo emergente Schizosaccharomyces japonicus10.

As técnicas numerosas estão disponíveis para estudar o índice e a dinâmica do LD. A maioria emprega algum tipo de coloração de LDs com corantes lipofílicos como o Nilo vermelho ou BODIPY 493/503. Este último apresenta espectros de excitação e emissão mais estreitos e especificidade aumentada em relação aos lipídios neutros (LDs) em oposição aos fosfolipídeos (membranas)11. Métodos fluimétricos e de fluxo-citometria têm sido utilizados com sucesso em várias espécies fúngicas para descobrir genes e condições de crescimento que afetam o conteúdo lipídico do armazenamento12,13,14,15. Embora esses métodos sejam adequados para aplicativos de alta taxa de transferência, eles não podem medir os números e a morfologia de LDs individuais nas células, o que pode diferir drasticamente entre as condições de crescimento e os genótipos. A dispersão coerente de Raman ou a microscopia holográfica digital são métodos Label-Free que produzem dados do LD-nível, mas exigem o equipamento caro especializado16,17,18. A microscopia de fluorescência, de um lado, pode fornecer dados detalhados no índice do LD, ao utilizar instrumentos geralmente disponíveis e ferramentas de software da análise de imagem. Existem vários fluxos de trabalho de análise que apresentam vários graus de sofisticação e automação na detecção de células/LD a partir de dados de imagem, e são otimizados para tipos de células diferentes, como células metazoários com grandes LDS19,20 , 21, ou leveduras de brotamento17,22,23. Algumas dessas abordagens só funcionam em 2D (por exemplo, em imagens de projeção máxima), o que pode não conseguir descrever de forma confiável o conteúdo de LD celular. A nosso conhecimento, nenhumas ferramentas existem para a determinação do índice do LD e da morfologia dos dados microscópicos da levedura da fissão. O desenvolvimento de análises automatizadas e robustas de nível LD traria maior sensibilidade e maior poder estatístico, e forneceria informações ricas sobre o teor de lipídios neutros, idealmente em várias espécies de leveduras.

Desenvolvemos um fluxo de trabalho para análise de conteúdo de LD a partir de imagens de microscopia de fluorescência 3D de células de levedura. Células ao vivo são manchadas com BODIPY 493/503 e Cascade Blue dextrano para visualizar os LDs e determinar os limites das células, respectivamente. As células são imobilizadas em lâminas de vidro e submetidas à imagem de pilha z usando um microscópio de epifluorescência padrão. As imagens são então processadas por um pipeline automatizado implementado no MATLAB, um pacote amplamente utilizado (comercial) para análises estatísticas. O pipeline realiza pré-processamento de imagens, segmentação (células versus fundo, remoção de células mortas) e identificação de LD. Os dados ricos do LD-nível, tais como o tamanho do LD e a intensidade da fluorescência, são fornecidos então em um formato tabular compatível com as ferramentas de software principais da folha de cálculo. O fluxo de trabalho foi utilizado com sucesso para determinar o impacto da disponibilidade da fonte de nitrogênio no metabolismo lipídico em S. pombe24. Agora Demonstramos a funcionalidade do fluxo de trabalho em s. pombe, s. japonicus e s. cerevisiae, usando condições de crescimento ou mutantes que afetam o conteúdo de LD celular.

Protocol

1. preparação de soluções e mídia Prepare a solução de coloração lipídica. Para preparar a solução de coloração lipídica de estoque dissolva 10 mg de BODIPY 493/503 em 10 mL de DMSO anidro (concentração final de 1 mg/mL). Dissolva todo o conteúdo de um frasco para injetáveis de 10 mg BODIPY 493/503 para evitar a perda de material durante a pesagem.Atenção: DMSO pode passar através da pele. Use equipamento de proteção individual apropriado….

Representative Results

Todo o procedimento é resumido na Figura 1 para as leveduras de fissão (o fluxo de trabalho de levedura de brotamento é análogo), e abaixo fornecemos exemplos de como o fluxo de trabalho pode ser usado para estudar o conteúdo de LD em três diferentes espécies de leveduras várias condições conhecidas afetar o conteúdo da LD celular. Cada exemplo representa um experimento biológico único. <img alt="Figure 1" class="xfigi…

Discussion

A compreensão do metabolismo lipídico e sua regulação é importante tanto para a biologia básica, quanto para aplicações clínicas e biotecnológicas. O teor de LD representa uma leitura conveniente do estado de metabolismo lipídico da célula, sendo a microscopia de fluorescência um dos principais métodos utilizados para determinação do teor de LD. O protocolo apresentado permite a deteção automatizada e a descrição quantitativa de LDs individuais em três espécies diferentes e morfològica distintas do…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Universidade Charles concede PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 e SVV 260310. Agradecemos a Ondřej Šebesta pela ajuda com microscopia e desenvolvimento do pipeline de análise de imagem. Agradecemos ao laboratório ReGenEx por cepas de s. cerevisiae e ao laboratório Japonet e Hironori Niki para cepas de s. japonicus . A cepa custos ppc1-88 foi fornecida pelo centro de recursos genéticos de levedura do Japão. A microscopia foi realizada no laboratório de microscopia confocal e de fluorescência cofinanciada pelo Fundo Europeu de desenvolvimento regional e pelo orçamento do estado da República Tcheca (projeto n º CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 e CZ. 2.16/3.1.00/21515).

Materials

12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) – Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

References

  1. Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
  2. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  3. Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
  4. Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
  5. Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).
  6. Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
  7. Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
  8. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
  9. Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
  10. Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
  11. Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
  12. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
  13. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
  14. Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
  15. Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
  16. Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
  17. Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
  18. Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
  19. Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
  20. Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
  21. Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
  22. Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
  23. Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
  24. Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
  25. Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
  26. Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
  27. Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
  28. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
  29. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
  32. Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
  33. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  34. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
  35. Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).

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Princová, J., Schätz, M., Ťupa, O., Převorovský, M. Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing. J. Vis. Exp. (149), e59889, doi:10.3791/59889 (2019).

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