Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Los lípidos desempeñan un papel crucial en la energía celular y el metabolismo del carbono, la síntesis de componentes de membrana y la producción de sustancias bioactivas. El metabolismo de los lípidos se ajusta según las condiciones ambientales, la disponibilidad de nutrientes y la fase¹del ciclo celular. En los seres humanos, el metabolismo de los lípidos se ha conectado a enfermedades, como la obesidad, la diabetes tipo II y el cáncer^2. En la industria, los lípidos producidos por microorganismos, como las levaduras, representan una fuente prometedora de combustibles diésel renovables³. Las células almacenan lípidos neutros en las llamadas gotas lipídicas (LD). Estos cuerpos evolutivamente conservados se componen de triacilgliceroles, ésteres de esteril, una monocapa fosfolípido externa y proteínas asociadas¹. Los LM se originan en el retículo endoplasmático, ejercen dinámicas de ciclo celular o fase de crecimiento, y son importantes para la homeostasis lipídica celular¹. El número de LD y la morfología se pueden utilizar como un proxy conveniente al analizar el metabolismo de los lípidos bajo diversas condiciones de crecimiento o al examinar un panel de mutantes. Dada su naturaleza dinámica, las técnicas capaces de analizar las propiedades de los DNl individuales son de particular interés en los estudios del metabolismo lipídico.

Varias especies de levadura se han utilizado para describir las vías metabólicas relacionadas con los lípidos y su regulación, o se utilizan en la biotecnología para producir compuestos o combustibles interesantes¹. Además, para levaduras modelo, tales como la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae o la levadura de fismo distantemente relacionada Schizosaccharomyces pombe, se encuentran disponibles bibliotecas de cepas de eliminación en todo el genoma que se pueden utilizar para un alto rendimiento pantallas^4,5. Recientemente la composición y dinámica de LD se han descrito en S. pombe^6,7,8,9, y mutantes relacionados con el metabolismo lipídico se han aislado en el modelo emergente de levadura Schizosaccharomyces japonicus¹⁰.

Numerosas técnicas están disponibles para estudiar el contenido y la dinámica de LD. La mayoría emplea algún tipo de tinción de Lutsisconlos con colorantes lipofílicos como Nile Red o BODIPY 493/503. Este último muestra espectros de excitación y emisión más estrechos, y una mayor especificidad hacia los lípidos neutros (LD) en comparación con los fosfolípidos (membranas)¹¹. Los métodos fluorimétricos y de citometría de flujo se han utilizado con éxito en varias especies de hongos para descubrir genes y condiciones de crecimiento que afectan al contenido de lípidos de almacenamiento^12,13,14,15. Si bien estos métodos son adecuados para aplicaciones de alto rendimiento, no pueden medir el número y la morfología de los D Individuales en las células, lo que puede diferir drásticamente entre las condiciones de crecimiento y los genotipos. La dispersión coherente de Raman o la microscopía holográfica digital son métodos sin etiquetas que producen datos a nivel de LD, pero requieren equipos especializados y costosos^16,17,18. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, puede proporcionar datos detallados sobre el contenido de LD, al tiempo que utiliza instrumentos comúnmente disponibles y herramientas de software de análisis de imágenes. Existen varios flujos de trabajo de análisis que cuentan con varios grados de sofisticación y automatización en la detección de celdas/LD a partir de datos de imagen, y están optimizados para diferentes tipos de celdas, como células metazoanas con grandes LD^{19,20 , 21}, o levaduras en ciernes^17,22,23. Algunos de estos enfoques solo funcionan en 2D (por ejemplo, en imágenes de proyección máxima), lo que puede no describir de forma fiable el contenido de LD celular. Hasta nuestro conocimiento, no existen herramientas para la determinación del contenido de LD y la morfología a partir de datos microscópicos de levadura de fesión. El desarrollo de análisis automatizados y robustos a nivel de LD traería mayor sensibilidad y mayor potencia estadística, y proporcionaría información rica sobre el contenido de lípidos neutros, idealmente en múltiples especies de levaduras.

Hemos desarrollado un flujo de trabajo para el análisis de contenido LD a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de células de levadura. Las celdas vivas se tiñen con BODIPY 493/503 y Cascade Blue dextran para visualizar los DD y determinar los límites de las celdas, respectivamente. Las células se inmovilizan en diapositivas de vidrio y se someten a imágenes de pila z utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar. Las imágenes son procesadas por una canalización automatizada implementada en MATLAB, un paquete ampliamente utilizado (comercial) para análisis estadísticos. La canalización realiza el preprocesamiento de imágenes, la segmentación (células frente al fondo, la eliminación de celdas muertas) y la identificación de LD. Los datos enriquecidos a nivel de LD, como el tamaño de LD y la intensidad de la fluorescencia, se proporcionan en un formato tabular compatible con las principales herramientas de software de hoja de cálculo. El flujo de trabajo se utilizó con éxito para determinar el impacto de la disponibilidad de la fuente de nitrógeno en el metabolismo de los lípidos en S. pombe²⁴. Ahora demostramos la funcionalidad del flujo de trabajo en S. pombe, S. japonicus y S. cerevisiae,utilizando condiciones de crecimiento o mutantes que afectan el contenido de LD celular.