自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

脂質は、細胞エネルギーや炭素代謝、膜成分の合成、生理活性物質の産生に重要な役割を果たします。脂質代謝は、環境条件、栄養素の利用可能性および細胞周期フェーズ1に応じて微調整される。ヒトでは、脂質代謝は、肥満、II型糖尿病および^癌2などの疾患に関連している。産業では、酵母などの微生物によって生成される脂質は、再生可能なディーゼル^燃料3の有望な供給源を表す。細胞は、いわゆる脂質液滴(LD)に中性脂質を格納します。これらの進化的に保存された体は、トリアシルグリセロール、ステリルエステル、外側リン脂質単層および関連タンパク^質1から構成される。LDsは小プラズム網膜に由来し、細胞周期または成長相力学を発揮し、細胞脂質恒常^性1にとって重要である。LD番号および形態は、様々な成長条件下で脂質代謝をアッセイするとき、または変異体のパネルをスクリーニングする際に便利なプロキシとして使用することができる。そのダイナミックな性質を考えると、個々のLDの特性を分析することができる技術は、脂質代謝の研究に特に関心がある。

様々な酵母種は、脂質関連代謝経路およびその調節を記述するために使用されてきた、または興味深い化合物または^燃料1を生成するためにバイオテクノロジーで使用されている。さらに、発芽酵母サッカロマイセスセレビシエや遠く関連する分裂酵母シゾサッカロマイセスポンベなどのモデル酵母については、ゲノム全体の欠失歪みライブラリを高スループットに使用できる利用可能です。画面4,⁵.最近、Ld組成物とダイナミクスはS.pombe6,7,8,9に記載されており、脂質代謝に関連する変異体は、新興モデル酵母中に単離されている。シゾサッカロマイセスジャポニカス¹⁰.

LDの内容とダイナミクスを研究するために、数多くの技術が利用可能です。ほとんどはナイルレッドやBODIPY 493/503などの親油性染料でLDのいくつかの種類の染色を採用しています。後者は、より狭い励起および放出スペクトルを示し、リン脂質(膜)11とは対照的に中性脂質(LD)に対する特異性の増加を示す。フッ素測定およびフローサイトメトリー法は、貯蔵脂質含有量12、13、14、15に影響を与える遺伝子および成長条件を明らかにするために、様々な真菌種で成功して使用されてきた。これらの方法はハイスループットアプリケーションに適していますが、細胞内の個々のLDの数と形態を測定することはできません。コヒーレントラマン散乱またはデジタルホログラフィック顕微鏡は、LDレベルのデータを生成するラベルフリーの方法ですが、特殊な高価な機器16、17、18^を必要とします。一方、蛍光顕微鏡は、一般的に利用可能な機器や画像解析ソフトウェアツールを利用しながら、LD含有量に関する詳細なデータを提供することができます。画像データからのセル/LD検出における様々な高度化と自動化を特徴とするいくつかの解析ワークフローが存在し、大きなLD^を持つメタゾン細胞など、異なる細胞タイプに最適化されています 19,^20,21, または発芽酵母^17,22,23.これらのアプローチの一部は、2D(例えば、最大投影画像)でのみ動作し、セルラーLD含有量を確実に記述できない場合があります。我々の知るうる場合、核分裂酵母顕微鏡データからLD含有量と形態を決定するためのツールは存在しない。自動化された堅牢なLDレベルの分析の開発は、感度の向上と高められた統計力をもたらし、理想的には複数の酵母種で、中性脂質含有量に関する豊富な情報を提供します。

酵母細胞の3D蛍光顕微鏡画像からLD含有量解析のワークフローを開発しました。生細胞は、BODIPY 493/503とカスケードブルーデキトランで染色され、それぞれLDを可視化し、細胞境界を決定します。細胞はガラススライド上に固定化され、標準的なエピ蛍光顕微鏡を使用してZスタックイメージングを行います。画像は、統計分析のために広く使用されている(商用)パッケージであるMATLABに実装された自動化されたパイプラインによって処理されます。パイプラインは、イメージ前処理、セグメンテーション (セルと背景、死んだセルの除去)、および LD 識別を実行します。LD サイズや蛍光強度などのリッチ LD レベルのデータは、主要なスプレッドシート ソフトウェア ツールと互換性のある表形式で提供されます。このワークフローは、S.pombe²⁴における脂質代謝に対する窒素源の利用可能性の影響を決定するために正常に使用された。次に、細胞の LD 含有量に影響を与える成長条件または変異体を使用して、S. pombe、S. japonicusおよび S. cerevisiaeのワークフローの機能を示します。