Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

I lipidi svolgono un ruolo cruciale nel metabolismo dell’energia cellulare e del carbonio, nella sintesi dei componenti della membrana e nella produzione di sostanze bioattive. Il metabolismo dei lipidi viene messo a punto in base alle condizioni ambientali, alla disponibilità di nutrienti e alla fase del ciclo cellulare¹. Nell’uomo, il metabolismo dei lipidi è stato collegato a malattie, come l’obesità, il diabete di tipo II e il cancro². Nell’industria, i lipidi prodotti da microrganismi, come i lieviti, rappresentano una fonte promettente di combustibili diesel rinnovabili^{3 .} Le cellule immagazzinano lipidi neutri nelle cosiddette goccioline di lipidi (LD). Questi corpi evolutivamente conservati sono composti da triacylglycerols, steryl esters, un monostrato esterno di fosfolipidi e proteine associate¹. Gli LD hanno origine nel reticolo endoplasmico, esercitano dinamiche del ciclo cellulare o della fase di crescita e sono importanti per l’omeostasi dei lipidi cellulari¹. Il numero LD e la morfologia possono essere utilizzati come un comodo proxy quando si analizza il metabolismo dei lipidi in varie condizioni di crescita o durante lo screening di un gruppo di mutanti. Data la loro natura dinamica, tecniche in grado di analizzare le proprietà dei singoli LD sono di particolare interesse negli studi sul metabolismo dei lipidi.

Varie specie di lievito sono state utilizzate per descrivere le vie metaboliche legate ai lipidi e la loro regolazione, o utilizzate nella biotecnologia per produrre composti o combustibili interessanti¹. Inoltre, per i lieviti modello, come il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae o il lievito di fissione lontano correlato Schizosaccharomyces pombe, sono disponibili librerie di deformazione di delezione a livello di genoma che possono essere utilizzati per schermi^4,5. Recentemente la composizione e la dinamica LD sono state descritte in S. pombe^6,7,8,9, e mutanti legati al metabolismo dei lipidi sono stati isolati nel lievito modello emergente Schizosaccharomyces japonicus¹⁰.

Sono disponibili numerose tecniche per studiare contenuti e dinamiche LD. La maggior parte impiega nodi di colorazione di LD con coloranti lipofili come Nile Red o BODIPY 493/503. Quest’ultimo mostra spettri di eccitazione ed emissione più stretti, e una maggiore specificità verso i lipidi neutri (LD) rispetto ai fosfolipidi (membrane)¹¹. I metodi fluorimetrici e di citometria di flusso sono stati utilizzati con successo in varie specie fungine per scoprire geni e condizioni di crescita che influenzano il contenuto lipidico di immagazzinamento^12,13,14,15. Sebbene questi metodi siano adatti per applicazioni ad alta produttività, non possono misurare i numeri e la morfologia dei singoli LD nelle cellule, che possono differire notevolmente tra le condizioni di crescita e i genotipi. La dispersione coerente Raman o la microscopia olografica digitale sono metodi privi di etichette che producono dati a livello di LD, ma richiedono attrezzature costose specializzate^16,17,18. La microscopia a fluorescenza, d’altra parte, può fornire dati dettagliati sul contenuto LD, utilizzando al contempo strumenti di analisi delle immagini e strumenti software di analisi delle immagini comunemente disponibili. Esistono diversi flussi di lavoro di analisi che presentano vari gradi di sofisticazione e automazione nel rilevamento di celle/LD dai dati immagine e sono ottimizzati per diversi tipi di cellule, come le celle metazoiconiche con LD di grandi dimensioni^{19,20 , 21}, o lieviti in erba^17,22,23. Alcuni di questi approcci funzionano solo in 2D (ad esempio, su immagini di proiezione massima), che potrebbero non riuscire a descrivere in modo affidabile il contenuto LD cellulare. A nostra conoscenza, non esistono strumenti per la determinazione del contenuto di LD e la morfologia da dati microscopici di lievito di fissione. Lo sviluppo di analisi automatizzate e robuste a livello di LD porterebbe una maggiore sensibilità e una maggiore potenza statistica e fornirebbe informazioni dettagliate sul contenuto di lipidi neutri, idealmente in più specie di lieviti.

Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per l’analisi dei contenuti LD da immagini di microscopia a fluorescenza 3D di cellule di lievito. Le celle vive sono colorate con BODIPY 493/503 e dextran Cascade Blue per visualizzare gli LD e determinare i limiti delle celle, rispettivamente. Le cellule sono immobilizzate su vetrini di vetro e sottoposte a imaging z-stack utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. Le immagini vengono poi elaborate da una pipeline automatizzata implementata in MATLAB, un pacchetto (commerciale) ampiamente utilizzato per le analisi statistiche. La pipeline esegue la pre-elaborazione delle immagini, la segmentazione (celle e sfondo, la rimozione delle celle morte) e l’identificazione LD. I dati avanzati a livello Di LD, come le dimensioni LD e l’intensità della fluorescenza, vengono quindi forniti in un formato tabulare compatibile con i principali strumenti software per fogli di calcolo. Il flusso di lavoro è stato utilizzato con successo per determinare l’impatto della disponibilità della fonte di azoto sul metabolismo dei lipidi in S. pombe²⁴. Ora dimostriamo la funzionalità del flusso di lavoro in S. pombe, S. japonicus e S. cerevisiae, utilizzando condizioni di crescita o mutanti che influenzano il contenuto lD cellulare.