Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à l'aide du traitement automatisé de l'image

Les lipides jouent un rôle crucial dans l’énergie cellulaire et le métabolisme du carbone, la synthèse des composants membranaires et la production de substances bioactives. Le métabolisme des lipides est affiné en fonction des conditions environnementales, de la disponibilité des nutriments et de la phase¹du cycle cellulaire. Chez l’homme, le métabolisme des lipides a été relié à des maladies telles que l’obésité, le diabète de type II et le cancer². Dans l’industrie, les lipides produits par les micro-organismes, comme les levures, représentent une source prometteuse de carburants diesel renouvelables³. Les cellules stockent les lipides neutres dans ce qu’on appelle les gouttelettes lipidiques (LD). Ces corps conservés de façon évolutive sont composés de triacylglycérols, d’esters de stéroyles, d’une monocouche phospholipide externe et de protéines associées¹. Les LD proviennent du réticulum endoplasmique, exercent une dynamique du cycle cellulaire ou de la phase de croissance, et sont importants pour l’homéostasie lipidique cellulaire¹. Le nombre De LD et la morphologie peuvent être utilisés comme un proxy commode en assérant le métabolisme de lipide dans diverses conditions de croissance ou en examinant un panneau de mutants. Compte tenu de leur nature dynamique, les techniques capables d’analyser les propriétés des LD individuels sont d’un intérêt particulier dans les études du métabolisme des lipides.

Diverses espèces de levures ont été utilisées pour décrire les voies métaboliques liées aux lipides et leur régulation, ou utilisées en biotechnologie pour produire des composés ou des carburants intéressants¹. En outre, pour les levures modèles, telles que la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae ou la levure de fission lointaine ment liée Schizosaccharomyces pombe, bibliothèques de souches de suppression à l’échelle du génome sont disponibles qui peuvent être utilisés pour le haut débit écrans^4,5. Récemment la composition et la dynamique de LD ont été décrites dans S. pombe^6,7,8,9, et les mutants liés au métabolisme de lipide ont été isolés dans la levure modèle émergente Schizosaccharomyces japonicus¹⁰.

De nombreuses techniques sont disponibles pour étudier le contenu et la dynamique LD. La plupart emploient une sorte de coloration de LD avec des colorants lipophiles tels que nile Red ou BODIPY 493/503. Ce dernier montre des spectres d’excitation et d’émission plus étroits, et une plus grande spécificité vers les lipides neutres (LD) par opposition aux phospholipides (membranes)¹¹. Les méthodes fluormétriques et de flux-cytométrie ont été utilisées avec succès dans diverses espèces fongiques pour découvrir des gènes et des conditions de croissance qui affectent la teneur en lipides de stockage^12,13,14,15. Bien que ces méthodes conviennent aux applications à haut débit, elles ne peuvent pas mesurer le nombre et la morphologie des LD individuels dans les cellules, qui peuvent différer considérablement entre les conditions de croissance et les génotypes. La diffusion cohérente de Raman ou la microscopie holographique numérique sont des méthodes sans étiquette qui produisent des données de niveau LD, mais exigent l’équipement coûteux spécialisé^16,17,18. La microscopie fluorescence, d’autre part, peut fournir des données détaillées sur le contenu LD, tout en utilisant des instruments couramment disponibles et des outils logiciels d’analyse d’images. Plusieurs workflows d’analyse existent qui comportent divers degrés de sophistication et d’automatisation dans la détection de cellules/LD à partir des données d’image, et sont optimisés pour différents types de cellules, tels que les cellules métazoaires avec de grands LD19^{,20 , 21}, ou levures en herbe^17,22,23. Certaines de ces approches ne fonctionnent qu’en 2D (p. ex., sur des images de projection maximale), ce qui peut ne pas décrire de façon fiable le contenu LD cellulaire. À notre connaissance, aucun outil n’existe pour déterminer le contenu et la morphologie de LD à partir des données microscopiques de levure de fission. Le développement d’analyses automatisées et robustes au niveau de la LD apporterait une sensibilité accrue et une puissance statistique accrue, et fournirait des informations riches sur la teneur en lipides neutres, idéalement chez plusieurs espèces de levures.

Nous avons développé un flux de travail pour l’analyse du contenu LD à partir d’images de microscopie de fluorescence 3D de cellules de levure. Les cellules vivantes sont tachées de BODIPY 493/503 et de Dextran Cascade Blue pour visualiser les LD et déterminer les limites cellulaires, respectivement. Les cellules sont immobilisées sur des lames de verre et soumises à l’imagerie par la pile z à l’aide d’un microscope à épifluorescence standard. Les images sont ensuite traitées par un pipeline automatisé mis en œuvre dans MATLAB, un paquet (commercial) largement utilisé pour les analyses statistiques. Le pipeline effectue le prétraitement de l’image, la segmentation (cellules par rapport à l’arrière-plan, l’élimination des cellules mortes) et l’identification LD. Les données riches au niveau LD, telles que la taille du LD et l’intensité de la fluorescence, sont ensuite fournies dans un format tabulaire compatible avec les principaux outils logiciels de feuilles de calcul. Le flux de travail a été utilisé avec succès pour déterminer l’impact de la disponibilité des sources d’azote sur le métabolisme des lipides dans S. pombe²⁴. Nous démontrons maintenant la fonctionnalité du flux de travail dans S. pombe, S. japonicus et S. cerevisiae, en utilisant des conditions de croissance ou des mutants qui affectent le contenu lD cellulaire.