Analyse des Lipidtröpfchengehalts in Spalt- und Budding-Hefen mittels automatisierter Bildverarbeitung
Summary
Hier stellen wir eine MATLAB-Implementierung des automatisierten Nachweises und der quantitativen Beschreibung von Lipidtröpfchen in Fluoreszenzmikroskopiebildern von Spalt- und angehenden Hefezellen vor.
Abstract
Der Fettstoffwechsel und seine Regulierung sind sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandten Biowissenschaften und die Biotechnologie von Interesse. In dieser Hinsicht werden verschiedene Hefearten als Modelle in der Fettstoffwechselforschung oder für die industrielle Lipidproduktion verwendet. Lipidtröpfchen sind hochdynamische Speicherkörper und ihr zellulärer Inhalt stellt eine bequeme Auslesung des Fettstoffwechselzustands dar. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Methode der Wahl für die quantitative Analyse zellulärer Lipidtröpfchen, da sie auf weit verbreitete Geräte angewiesen ist und die Analyse einzelner Lipidtröpfchen ermöglicht. Darüber hinaus kann die mikroskopische Bildanalyse automatisiert werden, was den Gesamtanalysedurchsatz erheblich erhöht. Hier beschreiben wir einen experimentellen und analytischen Workflow zur automatisierten Detektion und quantitativen Beschreibung einzelner Lipidtröpfchen in drei verschiedenen Modellhefearten: den Spalthefen Schizosaccharomyces pombe und Schizosaccharomyces japonicus, und die aufkeimende Hefe Saccharomyces cerevisiae. Lipidtröpfchen werden mit BODIPY 493/503 visualisiert, und zellunpermeablefluoreszierende Dextran wird den Kulturmedien hinzugefügt, um Zellgrenzen zu identifizieren. Zellen werden in grünen und blauen Kanälen der 3D-Epifluoreszenzmikroskopie unterzogen und die resultierenden Z-Stack-Bilder werden automatisch von einer MATLAB-Pipeline verarbeitet. Das Verfahren gibt umfangreiche quantitative Daten über den zellulären Lipidtröpfchengehalt und die individuellen Lipidtröpfcheneigenschaften in einem tabellarischen Format aus, das für nachgelagerte Analysen in großen Tabellen- oder statistischen Paketen geeignet ist. Wir bieten Beispielanalysen des Fetttröpfchengehalts unter verschiedenen Bedingungen, die den zellulären Fettstoffwechsel beeinflussen.
Introduction
Lipide spielen eine entscheidende Rolle im Zellenergie- und Kohlenstoffstoffwechsel, bei der Synthese von Membrankomponenten und bei der Produktion bioaktiver Substanzen. Der Fettstoffwechsel wird entsprechend den Umweltbedingungen, der Nährstoffverfügbarkeit und der Zellzyklusphase1abgestimmt. Beim Menschen ist der Fettstoffwechsel mit Krankheiten wie Fettleibigkeit, Typ-II-Diabetes und Krebs verbunden2. In der Industrie stellen Lipide, die von Mikroorganismen wie Hefen hergestellt werden, eine vielversprechende Quelle für erneuerbare Dieselkraftstoffedar 3. Zellen speichern neutrale Lipide in sogenannten Lipidtröpfchen (LDs). Diese evolutionär konservierten Körper bestehen aus Triacylglycerolen, Sterylestern, einer äußeren Phospholipid-Monoschicht und assoziierten Proteinen1. LDs stammen aus dem endoplasmatischen Retikulum, üben zellzyklus- oder Wachstumsphasendynamik aus und sind wichtig für die zelluläre Lipidhomöostase1. LD-Nummer und Morphologie können als bequemer Proxy verwendet werden, wenn sie den Fettstoffwechsel unter verschiedenen Wachstumsbedingungen untersuchen oder eine Gruppe von Mutanten untersuchen. Aufgrund ihrer dynamischen Natur sind Techniken, die in der Lage sind, die Eigenschaften einzelner LDs zu analysieren, von besonderem Interesse in Studien des Fettstoffwechsels.
Verschiedene Hefearten wurden verwendet, um lipidbedingte Stoffwechselwege und ihre Regulierung zu beschreiben, oder in der Biotechnologie verwendet, um interessante Verbindungen oder Brennstoffe zu produzieren1. Darüber hinaus stehen für Modellhefen, wie die angehende Hefe Saccharomyces cerevisiae oder die entfernt verwandte Spalthefe Schizosaccharomyces pombe,genomweite Deletionsstammbibliotheken zur Verfügung, die für Hochdurchsatz verwendet werden können. Bildschirme4,5. Kürzlich wurden LD-Zusammensetzung und -Dynamik in S. pombe6,7,8,9beschrieben und Mutanten im Zusammenhang mit dem Fettstoffwechsel wurden in der entstehenden Modellhefe isoliert Schizosaccharomyces japonicus10.
Es stehen zahlreiche Techniken zur Verfügung, um LD-Inhalte und -Dynamiken zu untersuchen. Die meisten verwenden eine Art von Färbung von LDs mit lipophilen Farbstoffen wie Nile Red oder BODIPY 493/503. Letzteres zeigt engere Anregungs- und Emissionsspektren und eine erhöhte Spezifität gegenüber neutralen Lipiden (LDs) im Gegensatz zu Phospholipiden (Membranen)11. Fluorimetrische und Strömungszytometrie-Methoden wurden erfolgreich in verschiedenen Pilzarten verwendet, um Gene und Wachstumsbedingungen aufzudecken, die den Speicherfettgehalt12,13,14,15beeinflussen. Obwohl diese Methoden für Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet sind, können sie die Anzahl und Morphologie einzelner LDs in Zellen nicht messen, die sich zwischen Wachstumsbedingungen und Genotypen dramatisch unterscheiden können. Kohärente Raman-Streuung oder digitale holographische Mikroskopie sind etikettenfreie Methoden, die Daten auf LD-Ebene liefern, aber spezielle teure Geräte erfordern16,17,18. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen kann detaillierte Daten zu LD-Inhalten liefern und gleichzeitig allgemein verfügbare Instrumente und Softwaretools zur Bildanalyse verwenden. Es gibt mehrere Analyse-Workflows, die unterschiedliche Raffinesse und Automatisierung in der Zell-/LD-Erkennung aus Bilddaten aufweisen und für verschiedene Zelltypen optimiert sind, z. B. metazoanische Zellen mit großen LDs19,20 , 21, oder angehende Hefen17,22,23. Einige dieser Ansätze funktionieren nur in 2D (z. B. bei maximalen Projektionsbildern), die den zellulären LD-Inhalt möglicherweise nicht zuverlässig beschreiben. Unserer Kenntnis nach gibt es keine Werkzeuge zur Bestimmung des LD-Gehalts und der Morphologie aus mikroskopischen Spalthefedaten. Die Entwicklung automatisierter und robuster Analysen auf LD-Ebene würde eine erhöhte Empfindlichkeit und erhöhte statistische Leistung bringen und umfassende Informationen über neutralen Lipidgehalt liefern, idealerweise bei mehreren Hefearten.
Wir haben einen Workflow für die LD-Inhaltsanalyse aus 3D-Fluoreszenzmikroskopiebildern von Hefezellen entwickelt. Lebende Zellen werden mit BODIPY 493/503 und Cascade Blue dextran gebeizt, um LDs zu visualisieren bzw. Zellgrenzen zu bestimmen. Zellen werden auf Glasdias immobilisiert und mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop einer Z-Stack-Bildgebung unterzogen. Die Bilder werden dann von einer automatisierten Pipeline verarbeitet, die in MATLAB, einem weit verbreiteten (kommerziellen) Paket für statistische Analysen, implementiert ist. Die Pipeline führt Bildvorverarbeitung, Segmentierung (Zellen vs. Hintergrund, Entfernen abgestorbener Zellen) und LD-Identifikation durch. Umfangreiche Daten auf LD-Ebene, wie LD-Größe und Fluoreszenzintensität, werden dann in einem tabellarischen Format bereitgestellt, das mit wichtigen Tabellenkalkulationssoftware-Tools kompatibel ist. Der Workflow wurde erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen der Stickstoffquellenverfügbarkeit auf den Fettstoffwechsel in S. pombe24zu bestimmen. Wir demonstrieren nun die Funktionalität des Workflows in S. pombe, S. japonicus und S. cerevisiae, mit Wachstumsbedingungen oder Mutanten, die zellulären LD-Gehalt beeinflussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Verständnis des Fettstoffwechsels und seiner Regulierung ist sowohl für die Grundbiologie als auch für klinische und biotechnologische Anwendungen wichtig. Der LD-Gehalt stellt eine bequeme Auslesung des Lipidstoffwechselzustands der Zelle dar, wobei die Fluoreszenzmikroskopie eine der wichtigsten Methoden zur Bestimmung des LD-Gehalts ist. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Detektion und quantitative Beschreibung einzelner LDs in drei verschiedenen und morphologisch unterschiedlichen Hefear…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der Karlsuniversität PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 und SVV 260310 unterstützt. Wir danken Ond’ej ebesta für die Hilfe bei der Mikroskopie und der Entwicklung der Bildanalyse-Pipeline. Wir danken dem ReGenEx-Labor für S. cerevisiae-Stämme und JapoNet und Hironori Nikis Labor für S. japonicus-Stämme. Der ppc1-88 Stamm wurde vom Yeast Genetic Resource Center Japan bereitgestellt. Die Mikroskopie wurde im Labor für Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, das vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung und dem Staatshaushalt der Tschechischen Republik kofinanziert wurde (Projekt Nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 und CZ.2.16/3.1.00/21515).
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
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