Тюнинг деградации для достижения конкретных и эффективных истощения белка
Summary
Здесь мы представляем протокол для эффективного и конкретного истощения белка, интересующегося дрожжами Saccharomyces cerevisiae с использованием системы q-est AID.
Abstract
Рецептор связывания auxin завода, TIR1, узнает протеины содержа специфически auxin-индуцируемого дегрюня (AID) motif в присутствии auxin, пристреливая их для деградации. Эта система используется во многих не-растение эукариоты, так что целевой белок, помечены с мотивом AID, деградирует на auxin того. Уровень выражения TIR1 имеет решающее значение; чрезмерное выражение приводит к деградации AID помечены белка даже в отсутствие auxin, в то время как низкое выражение приводит к медленному истощению. Была создана система AID, индуируемая с помощью AID, с выражением TIR1 под контролем индуцируемого промоутера, вызываемого в результате s-estradiol. Уровень TIR1 настраивается, изменяя время инкубации с помощью q-эстрадиола до добавления auxin. Этот протокол описывает, как быстро истощать целевой белок с помощью системы AID. Соответствующее время инкубации на эстрадиоле зависит от обилия белка-мишени. Таким образом, эффективное истощение зависит от оптимального времени, которое также сводит к минимуму аксин-независимое истощение.
Introduction
Условные мутации, такие как чувствительные к температуре мутанты, являются мощным инструментом для изучения основных белков, позволяя рост клеток при вседозволенном состоянии, но вызывая потерю функции при неразрешительных условиях. Тем не менее, метаболизм клеток может быть серьезно возмущен изменением условий роста, необходимых для индуцирования дефекта, а также может создать вне цели эффекты. Было разработано несколько методов, при которых интересуемый белок условно секвестрируется1 или его экспрессия контролируется 2,3 путем добавления небольшой молекулы. Этот протокол использует auxin и auxin-индуцируемую систему degron (AID) для эффективного истощения целевого белка.
Система AID имеет свое начало в растениях, где auxin (в этом протоколе indole-3-ацетической кислоты (IAA) используется), стимулирует взаимодействие Aux / IAA белка с TIR1, член SCF U3 убиквитин лигазе комплекса4. Комплексное взаимодействие SCF вызывает полиубичицинацию белков семейства Aux/IAA,что приводит к их деградации протеасомом 5,6.
Эта система была ранее адаптирована для использования в дрожжах Saccharomyces cerevisiae7,8, выражая белок TIR1 от Oriza sativa (osTIR) в дрожжевых клетках, где он способен взаимодействовать с эндогенными дрожжами Комплекс СКФ. Белок интерес был помечен с мотивом из белка Aux/IAA IAA17, чтобы нацелить его на деградацию. Функциональные усечения IAA17 были разработаны позже, такие как AID8,9,10, содержащий 43 аминокислоты auxin чувствительных мотив от Arabidopsis thaliana IAA17, наряду с эпитопом тег, чтобы включить Обнаружения.
Система первоначально адаптированы для использования в подающих надежды дрожжей7,8 выразил osTIR1 белка из дрожжей GAL промоутер. Выражение требует перехода к среде роста с галактозой в качестве единственного источника углерода, что, к сожалению, приводит к диоксовский сдвиг с широкими изменениями клеточного метаболизма11. С другой стороны, было сообщено, что составное выражение TIR1 может привести к деградации целевого белка при отсутствии вспомогательного/IAA12, если уровень экспрессии высок, в то время как низкое выражение TIR1 вызывает неэффективное истощение. Улучшенная система AID под названием «з-est AID» была разработана, в которой osTIR находится под контролем индуцируемого промотора, который настраивается на целевой белок, с минимальным влиянием на клеточный метаболизм. Для достижения этой цели был построен искусственный транскрипционный фактор (ATF), в котором активатор вирусной транскрипции VP16 сливается с рецептором эстрогена и четырех пальцев днк связывающей области (DBD). При поступлении в систему (эстроген) АТФ может войти в ядро и вызвать транскрипцию osTIR, связавшись с его промотором (No4EVpr)13,12.
osTIR выражение, как правило, обнаруживается около 20 мин после добавления з-эстрадиол12. Тем не менее, оптимальная продолжительность экспрессии osTIR для достижения эффективного истощения помеченного белка с помощью auxin, избегая при этом истощения до того, что необходимо эмпирически определить для каждого целевого белка. Приблизительное время для этой предварительной инкубации можно оценить по значениям изобилия в базе данных генома Сахаромицеса (SGD https://www.yeastgenome.org/). Как видно на рисунке 1, обильный белок, Dcp1 (2880 до 4189 молекул / клеток), требует 40 минут предварительной инкубации с й-эстрадиол, без каких-либо auxin-независимого истощения наблюдается. Гораздо менее обильный белок, Prp2 (172 до 211 молекул/ клеток), сильно истощен после всего лишь 20 минут предварительного инкубации. Рекомендуется проверить два дополнительных времени до инкубации, от 10 до 20 минут до или после этого первоначального расчетного времени (20 мин является минимальным временем, которое рекомендуется). Оптимальным временем предварительной инкубации является время, в которое целевой белок не истощается перед добавлением auxin и как только auxin добавляется истощение приемлемо или уровни белка приближаются к минимально возможному. Таким образом, с рисунка 1b, для Prp22 с 30 мин до инкубации, уровни не снизились много 10 минут после auxin дополнение. Сравнивая это с 40 мин до инкубации и 15 мин с IAA, где мало дополнительного истощения, нет никакой пользы в инкубации с auxin дольше, чем 10 мин или предварительного инкубации дольше, чем 30 мин, тем более, что есть доказательства не-оксин зависимое истощение на 40 мин. Для Dcp1 с 40 минутами pre-инкубации (последняя точка на которой уровень протеина приблизительно 100% перед добавлением auxin), 15 до 20 min истощения с auxin приемлемо. Рекомендуется держать время истощения как можно короче, чтобы уменьшить вторичное воздействие на метаболизм клеток14.
В этой статье показано, как использовать систему AID, оптимизируя время инкубации з-эстрадиола для экспрессии osTIR для достижения быстрого истощения целевого белка при добавлении IAA без истощения перед добавлением auxin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хорошо оптимизированный протокол может привести к быстрому и эффективному истощению целевого белка. Определение приблизительного времени до инкубации с помощью з-эстрадиола имеет важное значение, так как это увеличивает воспроизводимость истощения, но небольшие изменения в прединкубации времени можно мириться. С другой стороны, необходимо проявлять осторожность со сроками после того, как auxin addition, так как уровень белка снижается очень быстро.
Преимуществом такого подхода является то, что тюнингованое истощение может быть достигнуто путем различных комбинаций времени до инкубации с инкубированным временем К-эстрадиола и IAA. Например, при желании, целевой белок может быть более медленно истощены за счет сокращения времени до инкубации.
Система aid предлагает определенные преимущества по сравнению с системами, в которых osTIR является составно выраженной. Например, если целевой белок необходим для жизнеспособности, регулируемое выражение osTIR может избежать преждевременного истощения целевого белка. Кроме того, выражение osTIR может быть настроено в соответствии с обилием целевого белка и его восприимчивостью к деградации, и истощение может быть быстрым или медленным. Два небольших молекулных эффектора, з-эстрадиол и auxin, не возмущают метаболизм дрожжей в условиях, используемых здесь, в отличие от рапамицина, используемого в системе якоря-вне.
Следует отметить, что пометка некоторых белков нарушает их функцию, что является проблемой с любой целевой системы истощения. В этом случае тег N-терминала может работать, когда тег C-терминала не работает. Кроме того, не все белки будут истощаться эффективно; например, AID-тег на целевой белок может быть недоступен для белка osTIR. Таким образом, после AID-tagging, каждый целевой белок должен быть проверен на любое влияние метки на рост, и определить, является ли истощение эффективным, до времени до инкубации и лечения auxin.
Эта система АИДЗ очень проста и совместима с любой последующей экспериментальной процедурой, которая не предполагает дальнейшего роста, таких как белок, анализ ДНК или РНК или микроскопия. Кроме того, система хорошо работает в сочетании с тиомаркировкой для очищения зарождающейся РНК20.
Эта система обеспечивает быстрое, специфическое и воспроизводимое средство истощения белка, не влияя иначе на метаболизм дрожжевой клетки.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодаря Джейн Рид для начала этой программы, Барбара Terlouw для развития, Вахид Асланзаде для “ура петлер” конструкций и Сусана де Лукас для многих полезных дискуссий. Эта работа была поддержана стипендией для МГИМО от Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, Мексика (CONACYT) и Эдинбургского университета школы биологических наук, Wellcome PhD студентства в IEM (105256) и Wellcome финансирования (104648) в JD Beggs . Работа в Wellcome Центр клеточной биологии поддерживается Wellcome основного финансирования (092076).
Materials
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Β-estradiol | Sigma Aldrich | E2758-1G | 10mM solution in ethanol. Store at -20 oC |
| DMSO | Alfa Aesar | 42780 | DMSO should be solid at 4 oC |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
| IAA 1H-Indole-3-acetic acid | Across Orgainics | 122150100 | Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 oC. |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530 | |
| Peptone | Formedium | PEP03 | |
| SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
| Yeast Extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 |
References
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The Anchor-Away Technique: Rapid, Conditional Establishment of Yeast Mutant Phenotypes. Molecular Cell. 31, 925-932 (2008).
- Bellí, G., Garí, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, 942-947 (1998).
- Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
- Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. P. RING Domain E3 Ubiquitin Ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
- Tan, X., et al. Mechanism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase. Nature. 446, 640-645 (2007).
- Teale, W. D., Paponov, I. A., Palme, K. Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 847-859 (2006).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6, 917-922 (2009).
- Morawska, M., Ulrich, H. D. An expanded tool kit for the auxin-inducible degron system in budding yeast. Yeast. 30, 341-351 (2013).
- Kubota, T., Nishimura, K., Kanemaki, M. T., Donaldson, A. D. The Elg1 Replication Factor C-like Complex Functions in PCNA Unloading during DNA Replication. Molecular Cell. 50, 273-280 (2013).
- Brosh, R., et al. A dual molecular analogue tuner for dissecting protein function in mammalian cells. Nature Communications. 7, 11742 (2016).
- DeRisi, J. L., Iyer, V. R., Brown, P. O. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278, 680-686 (1997).
- Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding. Yeast. , (2018).
- McIsaac, R. S., et al. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Res. 41, e57 (2013).
- Prusty, R., Grisafi, P., Fink, G. R. The plant hormone indoleacetic acid induces invasive growth in Saccharomyces cerevisiae. PNAS. 101, 4153-4157 (2004).
- Geitz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiest, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20, 1425 (1992).
- Widlund, P. O., Davis, T. N. A high-efficiency method to replace essential genes with mutant alleles in yeast. Yeast. 22, 769-774 (2005).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-961 (1998).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , e52099 (2014).
- Volland, C., Urban-Grimal, D., Géraud, G., Haguenauer-Tsapis, R. Endocytosis and degradation of the yeast uracil permease under adverse conditions. Journal of Biological Chemistry. 269, 9833-9841 (1994).
- Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
