ضبط التدهور لتحقيق استنفاد البروتين محددة وفعالة
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لاستنفاد بشكل فعال وعلى وجه التحديد بروتين من الفائدة في الخميرة Saccharomyces سيريفيسياي باستخدام نظام بيتا-است AID.
Abstract
ومستقبلات ربط الأوكسين النبات، TIR1، تعترف البروتينات التي تحتوي على عزر degron الأوكسين-inducible محددة (AID) في وجود أوكسين، واستهدافها للتحلل. يتم استغلال هذا النظام في العديد من eukaryotes غير النباتية، بحيث يتم تحلل البروتين المستهدف، الموسومة عزر AID، عند إضافة أوكسين. ويعتبر مستوى تعبير TIR1 حاسماً؛ التعبير المفرط يؤدي إلى تدهور البروتين الموسومة AID حتى في غياب أوكسين، في حين أن انخفاض التعبير يؤدي إلى استنفاد بطيء. وقد أُنشئ نظام للمعونة القابلة للبث الذاتي، مع التعبير عن TIR1 تحت سيطرة مروج للاحتسradioات بيتا. مستوى TIR1 قابل للضبط عن طريق تغيير وقت الحضانة مع β-استراديول قبل إضافة أوكسين. يصف هذا البروتوكول كيفية استنفاد بروتين مستهدف بسرعة باستخدام نظام AID. يعتمد وقت الحضانة المناسب بيتا استراديول على وفرة البروتين المستهدف. ولذلك، فإن الاستنفاد الفعال يعتمد على التوقيت الأمثل الذي يقلل أيضا من استنفاد الأوكسين المستقلة.
Introduction
الطفرات المشروطة، مثل المتحولين الحساسة لدرجة الحرارة، هي أداة قوية لدراسة البروتينات الأساسية، مما يسمح بنمو الخلايا في ظل حالة متساهلة ولكن هافة فقدان الوظيفة في ظل ظروف غير متساهلة. ومع ذلك, استقلاب الخلايا يمكن أن تكون منزعجة بشكل خطير من قبل التغيير في ظروف النمو المطلوبة للحث على العيب، ويمكن أيضا خلق آثار خارج الهدف. وقد وضعت عدة طرق، حيث يتم عزل البروتين من الفائدة بشكل مشروط1 أو يتم التحكم في التعبير عنها2،3 عن طريق إضافة جزيء صغير. يستخدم هذا البروتوكول auxin ونظام degron auxin-inducible (AID) لاستنفاد البروتين المستهدف بكفاءة.
نظام AID له أصله في النباتات، حيث يستخدم أوكسين (في هذا البروتوكول حمض الخليك indole-3-acetic (IAA)، ويحفز التفاعل من البروتين Aux /IAA مع TIR1، وهو عضو في مجمع SCF U3 ubiquitin ligase4. SCF التفاعل المعقد يسبب تعدد الحوالي من البروتينات العائلية Aux / IAA ، مما يؤدي إلى تدهورها من قبل بروتياسوم5،6.
تم تكييف هذا النظام سابقا للاستخدام في الخميرة Saccharomyces سيريفيسياي7،8 عن طريق التعبير عن البروتين TIR1 من Oriza ساتيفا (osTIR) في خلايا الخميرة ، حيث أنها قادرة على التفاعل مع الخميرة الذاتية مجمع SCF. تم وضع علامة على البروتين من الاهتمام مع عزر من البروتين Aux/IAA IAA17 لاستهدافه للتدهور. تم تطوير الاقتطاع الوظيفي لـ IAA17 في وقت لاحق، مثل AID*8و9و10،الذي يحتوي على 43 زخرفة حساسة للحمض الأميني من Arabidopsis thaliana IAA17، جنبا إلى جنب مع علامة epitope لتمكين الكشف عن.
النظام تكييفها في البداية للاستخدام في الخميرة الناشئة7,8 أعرب عن البروتين osTIR1 من الخميرة GAL المروج. يتطلب التعبير التحول إلى متوسط النمو مع الجالاكتوز كمصدر الكربون الوحيد، والذي، للأسف، يؤدي إلى تحول ثنائي مع تغييرات واسعة النطاق لعملية التمثيل الغذائي للخلايا11. ومن ناحية أخرى، أُفيد بأن التعبير التأسيسي عن النقل الدولي الثالث عشر يمكن أن يؤدي إلى تدهور البروتين المستهدف في غياب الأوكسين/IAA12 إذا كان مستوى التعبير مرتفعاً، في حين أن انخفاض التعبير عن النقل بالتيراد عشر يسبب استنفاداً غير كفء. وقد تم تطوير نظام مساعدة محسن يسمى β-est AID الذي يخضع لـ osTIR لسيطرة مروج غير قابل للاستعمال يمكن ضبطه ليلائم البروتين المستهدف، مع الحد الأدنى من التأثير على استقلاب الخلايا. ولتحقيق ذلك، تم بناء عامل النسخ الاصطناعي (ATF) الذي يتم فيه دمج منشط النسخ الفيروسي VP16 لمستقبلات هرمون الاستروجين وأربعة أصابع زن DNA ربط المجال (DBD). عندما بيتا استراديول (الإستروجين) موجودة، يمكن للATF دخول النواة والحث على النسخ osTIR عن طريق ربط لمروجها (Z4EVpr)13،12.
التعبير osTIR عادة ما تكون قابلة للكشف عن حوالي 20 دقيقة بعد إضافة β-استراديول12. ومع ذلك، فإن المدة المثلى للتعبير osTIR لتحقيق استنفاد فعال للبروتين الموسومة مع أوكسين، مع تجنب استنفاد قبل auxin إضافة، يحتاج إلى تحديد تجريبي لكل بروتين المستهدفة. ويمكن تقدير الوقت التقريبي لهذا الحضانة قبل من قيم الوفرة في قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces (SGD https://www.yeastgenome.org/). كما هو الحال في الشكل 1، فإن البروتين الوفير، Dcp1 (2880 إلى 4189 جزيئات / خلية)، يتطلب 40 دقيقة من الحضانة قبل مع β-estradiol، مع عدم وجود استنفاد أوكسين مستقلة لوحظ. البروتين أقل وفرة بكثير، Prp2 (172 إلى 211 جزيئات / خلية)، ينضب بقوة بعد 20 دقيقة فقط من الحضانة قبل. من المستحسن اختبار وقتين إضافيين قبل الحضانة، 10 إلى 20 دقيقة قبل أو بعد هذا الوقت المقدر الأولي (20 دقيقة هو الحد الأدنى من الوقت الموصى به). الوقت الأمثل قبل الحضانة هو الوقت الذي البروتين المستهدف لم يستنفد قبل إضافة أوكسين وبمجرد إضافة أوكسين يتم قبول استنفاد أو مستويات البروتين تقترب من الحد الأدنى الممكن. لذلك، من الشكل 1b، لPrp22 مع 30 دقيقة من ما قبل الحضانة، ومستويات لم تنخفض كثيرا 10 دقيقة بعد auxin إضافة. مقارنة هذا مع 40 دقيقة من الحضانة و 15 دقيقة مع IAA، حيث لا يوجد استنفاد إضافي يذكر، لا فائدة في احتضان مع أوكسين أطول من 10 دقيقة أو قبل الحضانة لفترة أطول من 30 دقيقة، لا سيما أن هناك أدلة على عدم أوكسين استنفاد التابعة في 40 دقيقة. لDcp1 مع 40 دقيقة من ما قبل الحضانة (النقطة الأخيرة التي مستوى البروتين هو ما يقرب من 100٪ قبل auxin إضافة)، 15 إلى 20 دقيقة من استنفاد مع أوكسين هو مقبول. من المستحسن الحفاظ على وقت استنفاد قصيرة قدر الإمكان للحد من الآثار الثانوية على استقلاب الخلايا14.
توضح هذه المقالة كيفية استخدام نظام بيتا-است AID عن طريق تحسين توقيت حضانة بيتا استراديول للتعبير osTIR لتحقيق استنفاد البروتين المستهدف السريع على إضافة IAA دون استنفاد قبل إضافة أوكسين.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن أن يؤدي البروتوكول الأمثل إلى استنفاد سريع وفعال للبروتين المستهدف. ومن المهم تحديد الوقت التقريبي قبل الحضانة مع بيتا-استراديول، لأن هذا يزيد من قابلية الاستنفاد للاستنفاد، ولكن يمكن التسامح مع الاختلافات الصغيرة في وقت ما قبل الحضانة. من ناحية أخرى، يجب توخي الحذر مع توقيت بعد auxin إضافة، كما ينخفض مستوى البروتين بسرعة كبيرة.
ومن مزايا هذا النهج أن الاستنفاد المضبوط يمكن تحقيقه عن طريق مجموعات مختلفة من وقت ما قبل الحضانة مع وقت الحضانة بيتا-استراديول وIAA. على سبيل المثال، إذا رغبت في ذلك، يمكن استنفاد البروتين المستهدف ببطء أكبر عن طريق تقليل وقت ما قبل الحضانة.
ويوفر نظام المعونة المتكاملة مزايا معينة على النظم التي يتم فيها التعبير عن نظام “أوستير”. على سبيل المثال، إذا كان البروتين المستهدف ضروريًا للبقاء، فإن التعبير المنظم لـ osTIR يمكن أن يتجنب الاستنفاد المبكر للبروتين المستهدف. وعلاوة على ذلك، يمكن ضبط التعبير عن هذا التعبير ليتناسب مع وفرة البروتين المستهدف وقابليته للتحلل، ويمكن أن يكون الاستنفاد إما سريعاً أو بطيئاً. تأثيري جزيء صغير اثنين، β-استراديول وأوكسين، لا تعكر قكانة التمثيل الغذائي في ظل الظروف المستخدمة هنا، على عكس رابامايسين، وتستخدم في نظام مرساة بعيدا1.
وتجدر الإشارة إلى أن وضع علامات على بعض البروتينات يعطل وظيفتها، وهي مشكلة مع أي نظام استنفاد مستهدف. في هذه الحالة، قد تعمل علامة N-terminal عندما لا تعمل علامة المحطة الطرفية C. أيضا، لن يتم استنفاد جميع البروتينات بكفاءة. على سبيل المثال، قد يكون لا يمكن الوصول إلى البروتين OSTIR علامة AID على البروتين المستهدف. لذلك، بعد وضع العلامات AID، يجب اختبار كل بروتين الهدف لأي تأثير للعلامة على النمو، وتحديد ما إذا كان استنفاد فعالة، قبل أن يتم تحسين توقيت بيتا استراديول قبل الحضانة والعلاج أوكسين.
نظام AID* هذا بسيط جداً ومتوافق مع أي إجراء تجريبي لاحق لا ينطوي على مزيد من النمو، مثل تحليل البروتين أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الفحص المجهري. وبالإضافة إلى ذلك، يعمل النظام بشكل جيد عندما جنبا إلى جنب مع thiolabelling لتنقية RNA20الوليدة .
يوفر هذا النظام وسيلة سريعة ومحددة وقابلة للاستنساخ لاستنفاد البروتين دون التأثير على عملية التمثيل الغذائي لخلية الخميرة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وبفضل جين ريد على بدء هذا البرنامج، باربرا تيرلو من أجل التنمية، وحيد أصلانزاده لـ “أورا لوبير” وسوزانا دي لوكاس للعديد من المناقشات المفيدة. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة دراسية إلى المنظمة العالمية للشغل من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا، المكسيك (CONACYT) وكلية العلوم البيولوجية بجامعة إدنبرة، وهي طالبة دكتوراه في ويلكوم إلى المعهد [105256] وبتمويل من ويلكوم [104648] إلى التسول JD . ويدعم العمل في مركز ويلكوم لبيولوجيا الخلايا من قبل ويلكوم التمويل الأساسي [092076].
Materials
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Β-estradiol | Sigma Aldrich | E2758-1G | 10mM solution in ethanol. Store at -20 oC |
| DMSO | Alfa Aesar | 42780 | DMSO should be solid at 4 oC |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
| IAA 1H-Indole-3-acetic acid | Across Orgainics | 122150100 | Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 oC. |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530 | |
| Peptone | Formedium | PEP03 | |
| SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
| Yeast Extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 |
References
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The Anchor-Away Technique: Rapid, Conditional Establishment of Yeast Mutant Phenotypes. Molecular Cell. 31, 925-932 (2008).
- Bellí, G., Garí, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26, 942-947 (1998).
- Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
- Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. P. RING Domain E3 Ubiquitin Ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
- Tan, X., et al. Mechanism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase. Nature. 446, 640-645 (2007).
- Teale, W. D., Paponov, I. A., Palme, K. Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 847-859 (2006).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6, 917-922 (2009).
- Morawska, M., Ulrich, H. D. An expanded tool kit for the auxin-inducible degron system in budding yeast. Yeast. 30, 341-351 (2013).
- Kubota, T., Nishimura, K., Kanemaki, M. T., Donaldson, A. D. The Elg1 Replication Factor C-like Complex Functions in PCNA Unloading during DNA Replication. Molecular Cell. 50, 273-280 (2013).
- Brosh, R., et al. A dual molecular analogue tuner for dissecting protein function in mammalian cells. Nature Communications. 7, 11742 (2016).
- DeRisi, J. L., Iyer, V. R., Brown, P. O. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278, 680-686 (1997).
- Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding. Yeast. , (2018).
- McIsaac, R. S., et al. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Res. 41, e57 (2013).
- Prusty, R., Grisafi, P., Fink, G. R. The plant hormone indoleacetic acid induces invasive growth in Saccharomyces cerevisiae. PNAS. 101, 4153-4157 (2004).
- Geitz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiest, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20, 1425 (1992).
- Widlund, P. O., Davis, T. N. A high-efficiency method to replace essential genes with mutant alleles in yeast. Yeast. 22, 769-774 (2005).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-961 (1998).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , e52099 (2014).
- Volland, C., Urban-Grimal, D., Géraud, G., Haguenauer-Tsapis, R. Endocytosis and degradation of the yeast uracil permease under adverse conditions. Journal of Biological Chemistry. 269, 9833-9841 (1994).
- Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
