特定および効率的なタンパク質枯渇を達成するための分解性の調整
Summary
ここで、β-est AIDシステムを用いて酵母サッカロマイセスセレビシエに関心のあるタンパク質を効果的かつ具体的に枯渇させるプロトコルを提示する。
Abstract
植物性オーキシン結合受容体TIR1は、アウキシンの存在下で特定の補助誘導性デグロン(AID)モチーフを含むタンパク質を認識し、分解を標的とする。このシステムは、AIDモチーフでタグ付けされた標的タンパク質がauxin添加時に分解されるような多くの非植物真核生物で利用される。TIR1 式のレベルは重要です。過剰な発現は、アウキシンが存在しない場合でもAIDタグ付きタンパク質の分解を引き起こしますが、発現が低いと、枯渇が遅くなります。β-エストラジオール誘導性AIDシステムを作成し、β-エストラジオール誘導性プロモーターの制御下でTIR1を発現した。TIR1のレベルは、auxin添加の前にβ-エストラジオールでインキュベーションの時間を変更することによっても起立可能である。このプロトコルは、AIDシステムを使用して標的タンパク質を急速に枯渇させる方法について説明する。適切なβエストラジオールインキュベーション時間は、標的タンパク質の豊富さによって異なります。したがって、効率的な枯渇は、また、オーキシン独立性の枯渇を最小限に抑える最適なタイミングに依存します。
Introduction
温度感受性変異体などの条件付き突然変異は、必須タンパク質の研究のための強力なツールであり、寛容な条件下で細胞の成長を可能にするが、非寛容な条件下で機能の喪失を引き起こす。しかし、細胞代謝は、欠陥を誘発するために必要な成長条件の変化によって深刻に動揺し、また、オフターゲット効果を作成することができます。目的とするタンパク質が条件的に隔離されるいくつかの方法が開発され、その発現は、小分子を添加することによって2、3を制御する。 このプロトコルは、オーキシンおよび補助誘導性デグロン(AID)システムを使用して、標的タンパク質を効率的に枯渇させます。
AIDシステムは、アウキシン(このプロトコルではインドール-3-酢酸(IAA)が使用される植物に起源を有し、SCF U3ユビキチンリエーゼ複合体4のメンバーであるTIR1とのAux/IAAタンパク質の相互作用を刺激する。SCF複合体相互作用は、Aux/IAAファミリータンパク質のポリユビキチン化を引き起こし、プロテアソーム5,6による分解をもたらす。
このシステムは、酵母細胞内でオリザサティバ(osTIR)からTIR1タンパク質を発現させることにより、酵母サッカロマイセスセレビシエ7、8での使用に適応し、内因性酵母と相互作用することができる。SCF コンプレックス。目的のタンパク質は、Aux/IAAタンパク質IAA17をモチーフにタグ付けされ、分解を標的としました。IAA17の機能的切り捨ては、後にAID*8、9、10など、アラビドプシス・タリアナIAA17の43アミノ酸オーキシン感受性モチーフを含み、エピトープタグと共に開発された。検出。
このシステムは、最初に発芽酵母7、8における使用に適応し、酵母GALプロモーターからosTIR1タンパク質を発現した。発現は、ガラクトースを唯一の炭素源として成長培地にシフトする必要があり、残念ながら、細胞代謝11に広範囲の変化を伴う希釈シフトをもたらす。一方、TIR1の構成的発現は、発現レベルが高い場合はアウクシン/IAA12が存在しない場合に標的タンパク質の分解を引き起こす可能性がある一方、TIR1発現が低いと非効率な枯渇を引き起こすことが報告されている。β-est AIDという改良されたAIDシステムは、細胞代謝への影響を最小限に抑えながら、標的タンパク質に合わせて調節可能な誘導性プロモーターの制御下にある、β-est AIDという改良されたシステムが開発されました。これを達成するために、VP16ウイルス転写活性化剤がエストロゲン受容体と4本のZn指DNA結合ドメイン(DBD)に融合する人工転写因子(ATF)が構築された。βエストラジオール(エストロゲン)が存在する場合、ATFは核に入り、そのプロモーター(Z4EVpr)13,12に結合することによってosTIR転写を誘導することができる。
osTIR発現は、通常、β-エストラジオール12を添加した後、約20分で検出可能である。しかしながら、タグ付けされたタンパク質をオーキシンで効率的に枯渇させるosTIR発現の最適な持続時間は、auxin添加前の枯渇を回避しつつ、各標的タンパク質について経験的に決定する必要がある。このインキュベーション前のおおよその時間は、サッカロマイセスゲノムデータベース(SGDhttps://www.yeastgenome.org/)の豊富な値から推定することができます。図1に見られるように、豊富なタンパク質であるDcp1(2880~4189分子/細胞)は、β-エストラジオールによる40分の潜伏を必要とし、オーキシン非依存性の枯渇は認められない。はるかに少ない豊富なタンパク質、Prp2(172〜211分子/細胞)は、インキュベーション前のわずか20分後に強く枯渇する。この最初の推定時間の前または後に10〜20分(20分は推奨される最小時間である)の2つの追加の事前インキュベーション時間をテストすることをお勧めします。最適なインキュベーション時間は、ターゲットタンパク質がアウクシンを添加する前に枯渇していない時間であり、一度オーキシンを添加すると、枯渇が許容されるか、タンパク質レベルが可能な限り最小限に近づく。したがって、図1bから、プリインキュベーションの30分を有するPrp22の場合、レベルはauxin添加後10分あまり低下していない。これは、インキュベーション前の40分とIAAとの15分を比較すると、追加の枯渇がほとんどない場合、10分以上のオーキシンでインキュベーションを行ったり、30分以上のプレインキュベートを行ったりしても、特に非auxinの証拠があるので、利点はありません。40分で依存的な枯渇。プレインキュベーションの40分のDcp1(タンパク質レベルがauxin加算前に約100%である最後の点)の場合、15〜20分のオーキシンによる枯渇が許容される。細胞代謝14に対する二次的な影響を減らすために、枯渇時間をできるだけ短くしておくことをお勧めします。
本稿では、osTIR発現に対するβ-エストラジオールインキュベーションのタイミングを最適化し、オーキシンを添加する前にIAA添加時に急速な標的タンパク質枯渇を達成することにより、β-est AIDシステムを使用する方法を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
十分に最適化されたプロトコルは、標的タンパク質の迅速かつ効率的な枯渇を生成することができます。β-エストラジオールを使用して近似プリキュベーション時間を決定することは重要であり、これは枯渇の再現性を増加させるが、インキュベーション前の小さな変動は許容できる。一方、タンパク質レベルが急速に低下するにつれて、補助添加後のタイミングに注意が必要です。
このアプローチの利点は、β-エストラジオールおよびIAAインキュベーション時間との事前インキュベーション時間の組み合わせによって調整された枯渇を達成できることである。例えば、必要に応じて、標的タンパク質は、インキュベーション前の時間を短縮することによってよりゆっくりと枯渇させることができる。
β-est AIDシステムはOsTIRが構成的に発現されるシステムに対して一定の利点を提供する。例えば、標的タンパク質が生存に不可欠である場合、osTIRの調節発現は、標的タンパク質の早期枯渇を回避することができる。さらに、osTIRの発現は、標的タンパク質の豊富さと分解に対する感受性に合わせて調整することができ、枯渇は速いか遅いかのどちらかでありうる。2つの小分子エフェクター、β-エストラジオールおよびオーキシンは、ここで使用される条件下で酵母代謝を乱さない、ラパマイシンとは異なり、アンカーアウェイシステム1で使用される。
いくつかのタンパク質をタグ付けすると、その機能が破壊されることに留意すべきです, これは、任意の標的枯渇システムの問題である.この場合、C 端末タグが機能しない場合は、N 端末タグが機能する可能性があります。また、すべてのタンパク質が効率的に枯渇するわけではありません。例えば、標的タンパク質上のAIDタグは、osTIRタンパク質にアクセスできない場合があります。したがって、AIDタグの後、各標的タンパク質は、成長に対するタグの任意の効果をテストし、β-エストラジオール前インキュベーションおよびオーキシン処理のタイミングが最適化される前に、枯渇が有効であるかどうかを決定する必要があります。
このAID*システムは非常に簡単で、タンパク質、DNAまたはRNA分析または顕微鏡のようなさらなる成長を伴わない後続の実験手順と互換性がある。さらに、システムは、新生RNA20を浄化するためにチオラベリングと組み合わせるとうまく動作します。
このシステムは、酵母細胞の代謝に影響を与えることなく、タンパク質を枯渇させる迅速で、特異的で再現可能な手段を提供する。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプログラムを始めてくださったジェーン・リード、開発のためのバーバラ・テルルー、”ウラ・ルーパー”の構成物のためのヴァヒド・アスランザデ、多くの有益な議論のためのスサナ・デ・ルーカスのおかげで。この研究は、メキシコのコンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(CONACYT)とエジンバラ大学生物科学部からのGIMOへの奨学金、IEM[105256]へのウェルカム博士号の学生シップ、ウェルカム・ファンド[104648]からJDベッグスへの奨学金によって支援されました。.細胞生物学のためのウェルカムセンターでの仕事はウェルカムコア資金[092076]によってサポートされています。
Materials
| Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Β-estradiol | Sigma Aldrich | E2758-1G | 10mM solution in ethanol. Store at -20 oC |
| DMSO | Alfa Aesar | 42780 | DMSO should be solid at 4 oC |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
| IAA 1H-Indole-3-acetic acid | Across Orgainics | 122150100 | Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 oC. |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530 | |
| Peptone | Formedium | PEP03 | |
| SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
| Yeast Extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 |
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