Aquí, presentamos un protocolo para agotar de forma efectiva y específica una proteína de interés en la levadura Saccharomyces cerevisiae utilizando el sistema AID.
El receptor de unión a la auxina vegetal, TIR1, reconoce las proteínas que contienen un motivo específico de degron inducible en auxina (AID) en presencia de auxina, apuntando a su degradación. Este sistema se explota en muchos eucariotas no vegetales, de modo que una proteína diana, etiquetada con el motivo AID, se degrada a la adición de auxina. El nivel de expresión TIR1 es crítico; la expresión excesiva conduce a la degradación de la proteína etiquetada con AID incluso en ausencia de auxina, mientras que la baja expresión conduce a un agotamiento lento. Se creó un sistema de AYUDA inducible por estradiol, con la expresión de TIR1 bajo el control de un promotor inducible de estradiol. El nivel de TIR1 es ajustable cambiando el tiempo de incubación con el estradiol antes de la adición de auxina. Este protocolo describe cómo agotar rápidamente una proteína diana utilizando el sistema AID. El tiempo adecuado de incubación de estradiol depende de la abundancia de la proteína diana. Por lo tanto, el agotamiento eficiente depende de una sincronización óptima que también minimice el agotamiento independiente de la auxina.
Las mutaciones condicionales, como los mutantes sensibles a la temperatura, son una poderosa herramienta para el estudio de proteínas esenciales, permitiendo el crecimiento celular bajo la condición permisiva pero causando pérdida de función en condiciones no permisivas. Sin embargo, metabolismo celular puede ser seriamente perturbado por el cambio en las condiciones de crecimiento necesario para inducir el defecto y también puede crear efectos fuera del objetivo. Se han desarrollado varios métodos, en los que la proteína de interés se secuestra condicionalmente1 o su expresión se controla 2,3 mediante la adición de una molécula pequeña. Este protocolo utiliza la auxina y el sistema de degron inducible de auxina (AID) para agotar eficientemente una proteína diana.
El sistema AID tiene su origen en las plantas, donde se utiliza una auxina (en este protocolo indole-3-ácido acético (IAA), estimula la interacción dela proteína Aux/IAA con TIR1, miembro del complejo de ligasas ubiquitinas SCF U3 4. La interacción compleja de SCF causa poliubiquitinación de proteínas de la familia Aux/IAA, lo que resulta en su degradación por el proteosoma5,6.
Este sistema fue previamente adaptado para su uso en la levadura Saccharomyces cerevisiae7,8 expresando la proteína TIR1 de Oriza sativa (osTIR) en células de levadura, donde es capaz de interactuar con la levadura endógena Complejo SCF. La proteína de interés fue etiquetada con un motivo de la proteína Aux/IAA IAA17 para apuntar a su degradación. Los truncamientos funcionales de IAA17 se desarrollaron más tarde, como AID*8,9,10, que contiene el motivo 43 aminoácido sin ayuda sensible de Arabidopsis thaliana IAA17, junto con una etiqueta de epítopo para permitir Detección.
El sistema inicialmente adaptado para su uso en levadura en ciernes7,8 expresó la proteína osTIR1 de un promotor de GAL de levadura. La expresión requiere cambiar a medio de crecimiento con galactosa como única fuente de carbono, lo que, por desgracia, resulta en un cambio diónico con cambios de amplio alcance en el metabolismo celular11. Por otro lado, se ha informado de que la expresión constitutiva de TIR1 puede conducir a la degradación de la proteína diana en ausencia de auxina/IAA12 si el nivel de expresión es alto, mientras que la expresión TIR1 baja causa un agotamiento ineficiente. Se desarrolló un sistema de AID mejorado denominado AID en el que el osTIR está bajo el control de un promotor inducible que es ajustable para adaptarse a la proteína diana, con un efecto mínimo sobre el metabolismo celular. Para lograrlo, se construyó un factor de transcripción artificial (ATF) en el que el activador de transcripción viral VP16 se fusiona con un receptor de estrógenos y un dominio de unión al ADN (DBD) de cuatro dedos Zn. Cuando está presente el estradiol (un estrógeno), el ATF puede entrar en el núcleo e inducir la transcripción del osTIR uniéndose a su promotor (Z4EVpr)13,12.
la expresión osTIR suele ser detectable unos 20 minutos después de la adición de é-estradiol12. Sin embargo, la duración óptima de la expresión osTIR para lograr un agotamiento eficiente de la proteína etiquetada con auxina, evitando el agotamiento antes de la adición de auxina, debe determinarse empíricamente para cada proteína diana. Un tiempo aproximado para esta pre-incubación se puede estimar a partir de los valores de abundancia en la base de datos del genoma de Saccharomyces (SGD https://www.yeastgenome.org/). Como se puede observar en la Figura 1, la proteína abundante, Dcp1 (2880 a 4189 moléculas/célula), requiere 40 minutos de pre-incubación con el estradiol, sin agotamiento independiente de la auxina observado. La proteína mucho menos abundante, Prp2 (172 a 211 moléculas/célula), se agota fuertemente después de sólo 20 minutos de pre-incubación. Es aconsejable probar dos tiempos de pre-incubación adicionales, 10 a 20 minutos antes o después de este tiempo estimado inicial (20 min es el tiempo mínimo que se recomienda). El tiempo óptimo de pre-incubación es el momento en el que la proteína objetivo no se ha agotado antes de añadir auxina y una vez que se añade auxina el agotamiento es aceptable o los niveles de proteína se acercan al mínimo posible. Por lo tanto, de la Figura 1b, para Prp22 con 30 min de pre-incubación, los niveles no han disminuido mucho 10 minutos después de la adición de auxin. Comparando esto con 40 min de pre-incubación y 15 min con IAA, donde hay poco agotamiento adicional, no hay ningún beneficio en incubar con auxina de más de 10 minutos o pre-incubación por más de 30 min, particularmente porque hay evidencia de no auxina agotamiento dependiente a 40 min. Para Dcp1 con 40 min de pre-incubación (el último punto en el que el nivel de proteína es aproximadamente 100% antes de la adición de auxina), 15 a 20 minutos de agotamiento con auxina es aceptable. Se recomienda mantener el tiempo de agotamiento lo más corto posible para reducir los efectos secundarios sobre el metabolismo celular14.
En este artículo se demuestra cómo utilizar el sistema DE Ayuda mediante la optimización del momento de la incubación de é-estradiol para la expresión de osTIR para lograr un rápido agotamiento de la proteína diana en la adición de IAA sin agotamiento antes de agregar auxina.
Un protocolo bien optimizado puede producir un agotamiento rápido y eficiente de la proteína objetivo. Determinar el tiempo aproximado de pre-incubación con el estradiol es importante, ya que esto aumenta la reproducibilidad del agotamiento, pero se pueden tolerar pequeñas variaciones en el tiempo de pre-incubación. Por otro lado, se debe tener cuidado con el tiempo después de la adición de auxina, ya que el nivel de proteína disminuye muy rápidamente.
Una ventaja de este enfoque es que el agotamiento ajustado se puede lograr mediante diferentes combinaciones de tiempo de pre-incubación con el tiempo de incubación de la IAA y el estradiol. Por ejemplo, si se desea, la proteína diana puede agotarse más lentamente reduciendo el tiempo de preincubación.
El sistema AID ofrece ciertas ventajas sobre los sistemas en los que OsTIR se expresa de forma constitutiva. Por ejemplo, si la proteína diana es esencial para la viabilidad, la expresión regulada de osTIR puede evitar el agotamiento prematuro de la proteína diana. Además, la expresión de osTIR se puede ajustar para adaptarse a la abundancia de la proteína diana y su susceptibilidad a la degradación, y el agotamiento puede ser rápido o lento. Los dos pequeños efectores de moléculas, el estradiol y la auxina, no perturban el metabolismo de la levadura en las condiciones utilizadas aquí, a diferencia de la rapamicina, utilizada en el sistema de anclaje1.
Cabe señalar que el etiquetado de algunas proteínas interrumpe su función, que es un problema con cualquier sistema de agotamiento dirigido. En este caso, una etiqueta N-terminal puede funcionar cuando una etiqueta C-terminal no funciona. Además, no todas las proteínas se agotarán eficientemente; por ejemplo, la etiqueta AID de la proteína diana puede ser inaccesible para la proteína osTIR. Por lo tanto, después del etiquetado AID, cada proteína diana debe ser probada para cualquier efecto de la etiqueta en el crecimiento, y para determinar si el agotamiento es eficaz, antes de que se optimizan los plazos de pre-incubación de é-estradiol y tratamiento de auxina.
Este sistema AID* es muy simple y es compatible con cualquier procedimiento experimental posterior que no implique un mayor crecimiento, como el análisis de proteínas, ADN o ARN o la microscopía. Además, el sistema funciona bien cuando se combina con tiolabelling para purificar el ARN naciente20.
Este sistema proporciona un medio rápido, específico y reproducible de agotar una proteína sin afectar de otro modo el metabolismo de la célula de levadura.
The authors have nothing to disclose.
Gracias a Jane Reid por iniciar este programa, Barbara Terlouw para el desarrollo, Vahid Aslanzadeh para las construcciones “ura looper” y Susana de Lucas para muchas discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado por una beca para GIMO del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT) y la Escuela de Ciencias Biológicas de la Universidad de Edimburgo, una beca de doctorado wellcome a IEM [105256] y por Wellcome funding [104648] a JD Beggs . El trabajo en el Wellcome Centre for Cell Biology está respaldado por la financiación básica de Wellcome [092076].
Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
Agar | Formedium | AGA03 | |
Β-estradiol | Sigma Aldrich | E2758-1G | 10mM solution in ethanol. Store at -20 oC |
DMSO | Alfa Aesar | 42780 | DMSO should be solid at 4 oC |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
IAA 1H-Indole-3-acetic acid | Across Orgainics | 122150100 | Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 oC. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530 | |
Peptone | Formedium | PEP03 | |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Yeast Extract | Formedium | YEA03 | |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 |