脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成
Summary
生体膜融合は、特殊な融合タンパク質によって触媒されます。タンパク質のフソジェニック特性の測定は、脂質混合アッセイによって達成することができる。ERの同質融合を媒実化するタンパク質である組換えショウジョウバエを精製し、あらかじめ形成されたリポソームに再構成し、融合能力を試験する方法を提示する。
Abstract
膜融合は真核細胞における重要なプロセスです。融合を触媒するには特殊なタンパク質が必要です。アラストリンは、ERの同質性融合に関与する小プラズム網膜(ER)常駐タンパク質である。ここでは、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)とポリヒスチジンタグドロソフィラアラストシンを2ラウンドの親和性クロマトグラフィーで精製する方法を詳述する。インビトロで融合反応を研究するには、精製された融合タンパク質を脂質二重層に挿入する必要があります。リポソームは、脂質組成物およびサイズが調整されてもよいとして、理想的なモデル膜である。そのために、予め形成されたリポソームにショウジョウバエのアラストリンに対する洗剤除去による再構成法について述べた。いくつかの再構成方法が利用可能であるが、洗剤除去による再構成は、アラストシンおよび他の同様のタンパク質に適しているいくつかの利点を有する。この方法の利点は、高い再構成収率および再構成されたタンパク質の正しい向きを含む。この方法は、他の膜タンパク質およびプロテオリポソームを必要とする他のアプリケーションに拡張することができる。さらに、膜融合の測定として用いられるプロテオリポソームのFRETベース脂質混合アッセイについて述べる。
Introduction
膜融合は、多くの生物学的反応において重要なプロセスです。生物学的条件下では、膜融合は自発的ではなく、そのような反応を触媒するために特殊な融合タンパク質を必要とする1.ERホモティピック膜融合は、ダイナミン関連GTPaseアラストシン2によって動物に媒介される。同質融合におけるアラストシンの役割は、末梢ERの三方接合部の基本であり、細胞全体に広がる管状の大規模な相互接続ネットワークを構成する。アラストニンは、大きなGTPase、3つのらせん束中ドメイン、疎水性膜アンカー、および短い細胞質C末端尾3からなる保存されたドメイン形態を有する。組換えショウジョウバエアラトミンを伴うインビトロ研究では、リポソームに再構成すると、そのフソジェニック特性を維持することが示されている。ヒトホモロを含む他のアラストチンは、インビトロでの融合を要約することができませんでした。ここでは、GSTとポリヒスチジンを精製する方法論について、アラストシンの組換えショウジョウバエをタグ付けし、リポソームに再構成し、融合をアッセイする方法論を説明する。
インビトロでの膜融合の研究は、通常、フソジェニックタンパク質が膜アンカーを持っているため、課題を提示します。それらを研究するためには、モデル脂質二重層にそれらを再構成する必要があります。大きなユニラメラ小胞(LUV)は、脂質タンパク質相互作用を研究するのに有用なツールです。ここでは、タンパク質再構成および融合アッセイ用の異なる脂質組成物のLuVを作るシステムを提示する。LUVへの一体タンパク質の再構成は、有機溶媒媒介性再構成、機械的メカニズム、または洗剤支援再構成4を含む様々な方法によって達成することができる。ここでは、洗剤除去により予め形成されたリポソームにショウジョウバエのアラストシンを再構成する方法を提示する。この再構成法の利点は、高い再構成収率と脂質二重層におけるアラストシンの適切な配向を含む。さらに、この方法を通じて、タンパク質は乾燥したり有機溶媒にさらされたりせず、構造や機能を維持します。その欠点の中で、洗剤の存在はすべてのタンパク質に理想的ではない可能性があり、最終的なプロテオリポソームは、脂質二重層に何らかの洗剤を組み込む可能性があります。さらに透析は、より多くの洗剤を排除するために使用されてもよい。しかし、透析には時間がかかるため、タンパク質活性が失われる可能性があります。
アラストシンの融合活性を評価することは、前述の2として脂質混合アッセイによって決定することができる。ここでは、N-(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾル-4-yl(NBD)/リッサミンローダミンBスルホニル(ローダミン)標識脂質を介したアラストイン媒介融合を測定する方法を用いて述記する。このアッセイは、ドナー(標識された)プロテオリポソームと受諾器(ラベルなし)プロテオリポソームの融合を必要とする。FRET放出は、膜融合中の脂質混合の結果として、「標識された」リポソームから「標識されていない」リポソームへのドナー-受諾ペアの希釈として反応中に測定することができる(図1)5。このアッセイは膜融合の代理として機能するが、膜融合とヘミフュージョン(外側のリーフレットのみが混在する状態)を区別することに制限がある。この問題に対処するために、代替案は、ジチオニテによるNBDの外側のリーフレットクエンチングである。NBD/ロダミン脂質混合アッセイと同様の方法論に続いて、融合による任意のNBD FRET放出を外側のリーフレットを消光すると、内部リーフレット混合8に起因する。
内部水性含有量混合による代替融合アッセイアドレスフルフュージョンのみ5.その例としては、テルビウム(Tb)/ジピコリン酸(DPA)アッセイおよびアミノナフタレントリスルホン酸(ANTS)/p-キシレンビス(ピリジニウム)臭化物(DPX)アッセイがあります。Tb/DPAアッセイでは、カプセル化されたTbを持つリポソームのプールが混合され、封入されたDPAとリポソームと融合されます。融合時に、蛍光は[Tb(DPA)3]3-キレート複合体6内のDPAからTbへの内部エネルギー伝達を介して増加する。対照的に、ANTS/DPXアッセイの場合、ANTS蛍光はDPX7によって消光されます。これらのシステムは内部含有量の混合に対処する一方で、非カプセル化試薬の除去、ならびに蛍煙素の意図しない相互作用のために、リポソームのより詳細な調製が必要である。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでの方法は、アラストシン組換えの核融合活性を精製、再構成、測定するための効率的な方法を示す。機能的なアラストインの高い収率を確保するためにいくつかの重要なステップを考慮する必要があります。.アラストシンの発現は、凝集を避けるために低温(16°C)で行う必要があり、1つは0.4〜1.5 mg/mLの間の最終的な濃度を目指す必要があります。非常に希薄なタンパク質は、脂質比に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、マイケル・スターン博士と彼の研究室に対して、アラストイン関連プロジェクトに関する洞察とフィードバックに感謝します。この研究は、国立総合医学研究所[R01GM101377]と国立神経障害・脳卒中研究所[R01NS102676]によって支援されました。
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
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