Summary

Reconstitution assistée par détergent de Recombinant Drosophila Atlastin en Liposomes pour des essais de mélange de lipides

Published: July 03, 2019
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Summary

La fusion des membranes biologiques est catalysée par des protéines de fusion spécialisées. La mesure des propriétés fusogéniques des protéines peut être obtenue par des essais de mélange de lipides. Nous présentons une méthode pour purifier l’atlastine recombinante de Drosophila, une protéine qui médiatise la fusion homotypique de l’ER, la reconstituant aux liposomes préformés, et testant la capacité de fusion.

Abstract

La fusion de membrane est un processus crucial dans la cellule eucaryotique. Des protéines spécialisées sont nécessaires pour catalyser la fusion. Les atlastines sont des protéines réticulum-endoplasmiques (ER) impliquées dans la fusion homotypique de l’ER. Nous détaillons ici une méthode pour purifier un glutathion S-transferase (GST) et poly-histidine marqué Drosophila atlastin par deux séries de chromatographie d’affinité. L’étude des réactions de fusion in vitro nécessite l’insertion de protéines de fusion purifiées dans une couche lipidique. Les liposomes sont des membranes modèles idéales, car la composition et la taille des lipides peuvent être ajustées. À cette fin, nous décrivons une méthode de reconstitution par l’enlèvement de détergent pour drosophila atlastin dans les liposomes préformés. Tandis que plusieurs méthodes de reconstitution sont disponibles, la reconstitution par l’enlèvement de détergent a plusieurs avantages qui le rendent approprié pour des atlastins et d’autres protéines semblables. L’avantage de cette méthode comprend un rendement de reconstitution élevé et une orientation correcte de la protéine reconstituée. Cette méthode peut être étendue à d’autres protéines membranaires et à d’autres applications qui nécessitent des protéoliposomes. En outre, nous décrivons un test de mélange de lipides basé sur FRET des protéoliposomes utilisés comme mesure de la fusion de membrane.

Introduction

La fusion de membrane est un processus critique dans beaucoup de réactions biologiques. Dans des conditions biologiques, la fusion de la membrane n’est pas spontanée et nécessite des protéines de fusion spécialisées pour catalyser ces réactions1. ER fusion de membrane homotypic est médiée chez les animaux par le dynamin liés GTPase atlastin2. Le rôle d’Atlastin dans la fusion homotypique est fondamental pour les jonctions à trois voies dans les urgences périphériques, qui constituent un grand réseau interconnecté de tubules qui s’étendent dans toute la cellule. Les atlastines ont une morphologie de domaine conservée composée d’un grand GTPase, d’un domaine intermédiaire de faisceau detrois hélices, d’une ancre hydrophobe de membrane, et d’une courte queue Cytoplasmique C-terminal 3. Des études in vitro avec recombinant Drosophila atlastin ont montré que lorsqu’il est reconstitué en liposomes, il maintient ses propriétés fusogéniques. D’autres atlastines, y compris les homologs humains n’ont pas été en mesure de récapituler la fusion in vitro. Nous décrivons ici une méthodologie pour purifier une TPS et poly-histidine étiquetée recombinante Drosophila atlastin, la reconstituer en liposomes, et d’essayer la fusion.

L’étude de la fusion de membrane in vitro présente un défi car les protéines fusogéniques ont habituellement une ancre de membrane. Pour les étudier, il est nécessaire de les reconstituer en bicouches lipidiques modèles. Les grandes vésicules unilamellaires (LUV) sont un outil utile pour étudier les interactions entre protéines lipidiques. Nous présentons ici un système pour faire des VUS de différentes compositions lipidiques pour la reconstitution des protéines et les analyses de fusion. La reconstitution des protéines intégrales en JV peut être réalisée par une variété de méthodes, y compris,la reconstitution organique de solvant-négocié, les mécanismes mécaniques, ou la reconstitution assistée de détergent 4. Nous présentons ici une méthode pour reconstituer d’atlastin de Drosophila en liposomes préformés par l’enlèvement de détergent. Les avantages de cette méthode de reconstitution incluent des rendements élevés de reconstitution et l’orientation appropriée de l’atlastine dans la bicouche de lipide. En outre, grâce à cette méthode, la protéine n’est pas séchée ou exposée à des solvants organiques, maintenant ainsi la structure et la fonction. Parmi ses inconvénients, la présence de détergents peut ne pas être idéal pour toutes les protéines et les protéoliposomes finaux peuvent avoir un certain détergent incorporé dans la bicouche lipidique. D’autres dialyses peuvent être utilisées pour éliminer davantage le détergent. Cependant, la dialyse peut prendre beaucoup de temps et peut donc entraîner une perte d’activité protéique.

L’évaluation de l’activité de fusion de l’atlastine peut être déterminée par des essais de mélange de lipides comme décrit précédemment2. Ici, nous délinons une méthode pour mesurer la fusion médiée par N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) lipides étiquetés. Cet test nécessite la fusion de protéoliposomes donneurs (étiquetés) et de protéoliposomes accepteurs (non étiquetés). Une libération de FRET peut être mesurée au cours de la réaction comme la dilution d’une paire donneur-acceptant de liposomes « étiquetés » à des liposomes « non étiquetés » à la suite du mélange de lipides pendant la fusion de membrane (figure 1)5. Bien que cet assay serve de proxy pour la fusion de membrane, il est limité dans la distinction entre la fusion de membrane et l’hémifusion, un état où seuls les folioles extérieures se mélangent. Pour résoudre ce problème, une alternative est l’étanchéité externe de la DNB par la dithionite. Suivant la même méthodologie que NBD/rhodamine lipides mélangeant des essais, lors de l’étanchéité du dépliant externe toute libération NBD FRET par fusion sera due à la foliole interne mélange8.

Des essais alternatifs de fusion par le contenu aqueux intérieur mélangeant l’adresse pleine fusion seulement5. Des exemples de ceci sont le terbium (Tb)/acide dipicolinique (DPA) essais et l’acide trisulfonic aminonaphthalene (ANTS)/p-xylène bis (pyridinium) bromure (DPX) essais. Dans tb/DPA, un pool de liposomes avec tb encapsulé sont mélangés et fusionnés avec des liposomes avec dPA encapsulé; lors de la fusion, la fluorescence est augmentée par transfert d’énergie interne de DPA à Tb dans le [Tb(DPA)3]3- chelation complexe6. En revanche, pour les essais ANTS/DPX, la fluorescence ANTS est étanchée par DPX7. Bien que ces systèmes traitent du mélange de contenu interne, une préparation plus approfondie des liposomes est nécessaire pour l’élimination des réactifs non encapsulés, ainsi que l’interaction involontaire des fluorophores.

Protocol

1. Purification de la TPS-DAtl-His8 Expression protéique et préparation du lysate Transformez BL21 (DE3) E. coli avec la construction GST-DAtl-His8 en pGEX4-T32 et sélectionnez sur une plaque d’ampicilline. Sélectionnez un seul transformateur et inoculez 5 ml d’ampicilline LB (5 l d’ampicilline de 100 mg/mL) dans un tube de culture de 14 ml et incubez à 25 oC en secouant à 200 tr/min pendant 6 à 8 h.REMARQUE: En raison de l’e…

Representative Results

L’efficacité de la reconstitution de l’atlastine est présentée à la figure 2. Des protéoliposomes reconstitués ont été flottés dans un gradient discontinu d’iohexol. Les protéines non incorporées ont été sédimentées dans la couche inférieure (B) ou dans la couche moyenne (M). La protéine reconstituée flotterait vers la couche supérieure (T). Des échantillons du gradient ont été récoltés et analysés par SDS-PAGE et Coomassie coloration. La quantification du gel par de…

Discussion

Les méthodes ici délimiter une méthode efficace pour purifier, reconstituer, et mesurer l’activité de fusion de l’atlastine recombinante. Pour assurer des rendements élevés de l’atlastine fonctionnelle, certaines étapes critiques doivent être prises en considération. L’expression de l’atlastine doit être faite à basse température (16 oC) pour éviter l’agrégation et il faut viser une concentration finale entre 0,4 et 1,5 mg/mL. Les protéines très diluées ne seront pas reconstituées de manière optimale ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Michael Stern et son laboratoire pour leurs idées et leurs commentaires sur les projets liés à l’atlastine. Ces travaux ont été soutenus par l’Institut national des sciences médicales générales [R01GM101377] et l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux [R01NS102676].

Materials

10 mL poly-prep chromatography columns Biored 731-1550
10 x 75 mm Flint glass tubes VWR 608225-402
47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters Whatman 7141 104
96 well white plate NUNC 437796
Anapoe X-100 Anatrace 9002-931-1
Cell disrupter Avestin Avestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) Avanti 840035P-10mg DOPS
EDTA Research organics inc. 6381-92-6 Ethylenediaminetetraacetic acid
EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 Complete protease inhibitor
Extruder Sigma Aldrich Z373400  Liposofast Basic Extruder
GE Akta Prime liquid chromatography system GE Pharmacia 8149-30-0006
Glutathione agarose beads Sigma aldrich G4510-50ml
Glycerol EMD GX0185-5
GTP Sigma Aldrich 36051-31-7 Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate
HEPES, acid free Omnipur 5330
Imidazole fluka 5670
Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column GE Healthcare 17040801 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns
Iohexol Accurate chemical and scientific corporation AN 7050 BLK Accudenz/Nycodenz
IPTG Research products international corp. I56000-100.0 IPTG, dioxane free
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5g
Magnesium chloride Fisher 7791-18-6
Methanol Omnisolv MX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) Avanti 236495 NBD-DPPE
n-Dodecyl β-D-maltoside Chem-Impex International 21950
Nonpolar polystyrene adsorbent beads BioRad 152-3920 SM2 Biobeads
Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane Whatman 800309
Optima LE80K Ultra centrifuge Beckman Coulter
Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] ARC ART0284 Titriated lipids
Plate reader TECAN TECAN infinite M200 plate reader
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti 850457C-25mg POPC
Potassium chloride MP 151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) Avanti 236495 Rh-DPPE
Scintillation Cocktail National Diagnostics LS-272 Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples
Scintillation vials Beckman 592928 Fast turn cap Mini Poly-Q Vial
Thrombin Sigma T1063-1kU Thrombin from human plasma
Triton X-100 Fisher BP151-500
Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm Beckman 344090
Vortex 9 to 13mm Tube Holder VWR 58816-138 Insert for vortexing flint glass tubes
Vortex Insert Retainer VWR 58816-132 Retainer needed for vortex tube holder
Vortexer VWR 2.235074 Vortex Genie 2 model G560
β-mercaptoethanol molecular biology grade Calbiochem 444203

References

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Cite This Article
Betancourt-Solis, M. A., McNew, J. A. Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays. J. Vis. Exp. (149), e59867, doi:10.3791/59867 (2019).

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