Summary

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Published: July 03, 2019
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Summary

Die biologische Membranfusion wird durch spezialisierte Fusionsproteine katalysiert. Die Messung der fusogenen Eigenschaften von Proteinen kann durch Lipid-Mischtests erreicht werden. Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung des rekombinanten Drosophila Atlastin, ein Protein, das die homotypische Fusion des ER vermittelt, es zu vorgeformten Liposomen restituiert und auf Fusionskapazität getestet wird.

Abstract

Die Membranfusion ist ein entscheidender Prozess in der eukaryotischen Zelle. Spezielle Proteine sind notwendig, um die Fusion zu katalysieren. Atlastine sind endoplasmatische Retikulum (ER) gebietsansässige Proteine, die an der homotypischen Fusion des ER beteiligt sind. Wir beschreiben hier eine Methode zur Reinigung einer Glutathion-S-Transferase (GST) und Polyhistidin mit dem Tag Drosophila atlastin durch zwei Runden Affinitätschromatographie. Die Untersuchung von Fusionsreaktionen in vitro erfordert das Einsetzen gereinigter Fusionsproteine in eine Lipid-Bilayerin. Liposomen sind ideale Modellmembranen, da Lipidzusammensetzung und -größe angepasst werden können. Zu diesem Zweck beschreiben wir ein Rekonstitutionsverfahren durch Waschmittelentfernung für Drosophila Atlastin in vorgeformte Liposomen. Während mehrere Rekonstitutionsmethoden zur Verfügung stehen, hat die Rekonstitution durch Waschmittelentfernung mehrere Vorteile, die es für Atlastine und andere ähnliche Proteine geeignet machen. Der Vorteil dieser Methode ist eine hohe Rekonstitutionsausbeute und die korrekte Ausrichtung des rekonstituierten Proteins. Diese Methode kann auf andere Membranproteine und für andere Anwendungen ausgedehnt werden, die Proteoliposomen erfordern. Zusätzlich beschreiben wir einen FRET-basierten Lipid-Mischtest von Proteoliposomen, die als Messung der Membranfusion verwendet werden.

Introduction

Membranfusion ist ein kritischer Prozess in vielen biologischen Reaktionen. Unter biologischen Bedingungen ist die Membranfusion nicht spontan und erfordert spezielle Fusionsproteine, um solche Reaktionen zu katalysieren1. ER homotypische Membranfusion wird bei Tieren durch die Dynamin-ähnliche GTPase Atlastin2vermittelt. Atlastins Rolle bei der homotypischen Fusion ist von grundlegender Bedeutung für Drei-Wege-Kreuzungen im peripheren ER, das ein großes miteinander verbundenes Netz von Tubuli bildet, die sich über die gesamte Zelle erstrecken. Atlastine haben eine konservierte Domänenmorphologie, bestehend aus einer großen GTPase, einer drei Helix-Bundle-Mitteldomäne, einem hydrophoben Membrananker und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminalschwanz3. In-vitro-Studien mit rekombinantem Drosophila Atlastin haben gezeigt, dass es bei rekonstituiert er zu Liposomen seine fusogene Eigenschaften beibehält. Andere Atlastine, einschließlich menschlicher Homologe, konnten die Fusion in vitro nicht rekapitulieren. Wir beschreiben hier eine Methode zur Reinigung einer GST und Poly-Histidin getaggt rekombinanten Drosophila Atlastin, Rekonstituierung zu Liposomen, und Assaying Fusion.

Das Studium der Membranfusion in vitro stellt eine Herausforderung dar, da fusogene Proteine in der Regel einen Membrananker haben. Um sie zu studieren, ist es notwendig, sie in Modelllipid-Doppelschichten zu rekonstituieren. Große unilamellare Vesikel (LUV) sind ein nützliches Werkzeug, um Lipidprotein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Wir präsentieren hier ein System zur Herstellung von LUVs aus verschiedenen Lipidzusammensetzungen für Proteinrekonstitution und Fusionstests. Die Rekonstitution von integralen Proteinen in LUVs kann durch eine Vielzahl von Methoden erreicht werden, einschließlich organischer lösungsmittelvermittelter Rekonstitution, mechanischer Mechanismen oder waschmittelunterstützter Rekonstitution4. Wir präsentieren hier eine Methode zur Rekonstituierung von Drosophila-Atlastin in vorgeformte Liposomen durch Waschmittelentfernung. Zu den Vorteilen dieser Rekonstitutionsmethode gehören hohe Rekonstitutionsausbeuten und die richtige Ausrichtung von Atlastin in der Lipid-Bilayer. Darüber hinaus wird das Protein durch diese Methode nicht getrocknet oder organischen Lösungsmitteln ausgesetzt, wodurch Struktur und Funktion erhalten bleiben. Unter seinen Nachteilen ist das Vorhandensein von Detergenzien möglicherweise nicht ideal für alle Proteine und die endgültigen Proteoliposomen können ein eingebautes Reinigungsmittel in die Lipid-Bilayer haben. Weitere Dialyse kann verwendet werden, um mehr von dem Waschmittel zu beseitigen. Die Dialyse kann jedoch lange dauern und kann daher zum Verlust der Proteinaktivität führen.

Die Beurteilung der Fusionsaktivität von Atlastin kann durch Lipid-Mischtests wie zuvor beschrieben bestimmt werden2. Hier wird ein Verfahren zur Messung der atlastin vermittelten Fusion durch N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl(NBD)/Lissamine rhodamine-B Sulfonyl (Rhodamine) mit Lipiden beschrieben. Dieser Test erfordert die Fusion von Spenderproteoliposomen und Akzeptor-Proteoliposomen. Eine FRET-Freisetzung kann während der Reaktion als Verdünnung eines Spender-Akzeptor-Paares von “markierten” Liposomen zu “unbeschrifteten” Liposomen als Folge der Lipidmischung während der Membranfusion gemessen werden (Abbildung 1)5. Während dieser Assay als Proxy für die Membranfusion dient, ist er bei der Unterscheidung zwischen Membranfusion und Hemifusion begrenzt, einem Zustand, in dem sich nur die äußeren Blättchen vermischen. Um dieses Problem zu beheben, ist eine Alternative das Abschrecken von NBD durch Dithionit. Nach der gleichen Methode wie NBD/Rhodamine Lipid-Mischtests, nach dem Abschrecken der äußeren Packungsbeilage wird jede NBD FRET Freisetzung durch Fusion durch innere Packungsbeilage Mischen8.

Alternative Fusionsassays durch innerwässriges Mischen adressieren voll fusion nur5. Beispiele hierfür sind Terbium (Tb)/Dipicolinsäure (DPA) Assays und Aminonaphthalintrisulfonsäure (ANTS)/p-Xylol bis(pyridinium) bromid (DPX) Assays. In Tb/DPA-Assays wird ein Pool von Liposomen mit gekapseltem Tb gemischt und mit Liposomen mit gekapseltem DPA verschmolzen; bei fusion wird die Fluoreszenz durch interne Energieübertragung von DPA zu Tb innerhalb des [Tb(DPA)3]3- Chelationskomplexes6erhöht. Im Gegensatz dazu wird ants Fluoreszenz bei ANTS/DPX-Assays durch DPX7abgeschreckt. Während diese Systeme die Mischung des inneren Inhalts betreffen, ist eine eingehendere Herstellung von Liposomen erforderlich, um nicht verkapselte Reagenzien sowie unbeabsichtigte Wechselwirkungen der Fluorophore zu entfernen.

Protocol

1. Reinigung von GST-DAtl-His8 Proteinexpression und Lysatzubereitung Transformieren Sie BL21 (DE3) E. coli mit dem GST-DAtl-His8-Konstrukt in pGEX4-T32 und wählen Sie auf einer Ampicillinplatte. Wählen Sie ein einzelnes Transformant und impfen 5 ml LB + Ampicillin (5 l von 100 mg/ml Ampicillin) in einem 14 ml Kulturrohr und inkubieren bei 25 °C mit Schütteln bei 200 U/min für 6-8 h.HINWEIS: Aufgrund der undichten Expression wi…

Representative Results

Die Effizienz der Atlastin-Rekonstitution ist in Abbildung 2dargestellt. Rekonstituierte Proteoliposomen wurden in einem diskontinuierlichen Ozorgradienten von Iohexol geflogen. Das nicht inkorporierte Protein wurde in der unteren Schicht (B) oder in der mittleren Schicht (M) sedimentiert. Rekonstituiertes Protein würde in die oberste Schicht (T) schweben. Proben des Gradienten wurden geerntet und von SDS-PAGE und Coomassie Färbung analysiert. Die Quantifizierung des Gels durch Densitometr…

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden eine effiziente Methode zur Reinigung, Rekonstituierung und Messung der Fusionsaktivität von rekombinantem Atlastin. Um eine hohe Ausbeute an funktionellem Atlastin zu gewährleisten, müssen einige kritische Schritte in Betracht gezogen werden. Die Expression von Atlastin muss bei niedrigen Temperaturen (16 °C) erfolgen, um eine Aggregation zu vermeiden, und man sollte eine Endkonzentration zwischen 0,4 und 1,5 mg/ml anstreben. Sehr verdünntes Protein wird nicht optimal mit einem Prote…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Michael Stern und seinem Labor für ihre Erkenntnisse und Ihr Feedback zu atlastin bezogenen Projekten. Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] und dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke [R01NS102676] unterstützt.

Materials

10 mL poly-prep chromatography columns Biored 731-1550
10 x 75 mm Flint glass tubes VWR 608225-402
47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters Whatman 7141 104
96 well white plate NUNC 437796
Anapoe X-100 Anatrace 9002-931-1
Cell disrupter Avestin Avestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) Avanti 840035P-10mg DOPS
EDTA Research organics inc. 6381-92-6 Ethylenediaminetetraacetic acid
EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 Complete protease inhibitor
Extruder Sigma Aldrich Z373400  Liposofast Basic Extruder
GE Akta Prime liquid chromatography system GE Pharmacia 8149-30-0006
Glutathione agarose beads Sigma aldrich G4510-50ml
Glycerol EMD GX0185-5
GTP Sigma Aldrich 36051-31-7 Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate
HEPES, acid free Omnipur 5330
Imidazole fluka 5670
Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column GE Healthcare 17040801 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns
Iohexol Accurate chemical and scientific corporation AN 7050 BLK Accudenz/Nycodenz
IPTG Research products international corp. I56000-100.0 IPTG, dioxane free
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5g
Magnesium chloride Fisher 7791-18-6
Methanol Omnisolv MX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) Avanti 236495 NBD-DPPE
n-Dodecyl β-D-maltoside Chem-Impex International 21950
Nonpolar polystyrene adsorbent beads BioRad 152-3920 SM2 Biobeads
Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane Whatman 800309
Optima LE80K Ultra centrifuge Beckman Coulter
Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] ARC ART0284 Titriated lipids
Plate reader TECAN TECAN infinite M200 plate reader
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti 850457C-25mg POPC
Potassium chloride MP 151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) Avanti 236495 Rh-DPPE
Scintillation Cocktail National Diagnostics LS-272 Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples
Scintillation vials Beckman 592928 Fast turn cap Mini Poly-Q Vial
Thrombin Sigma T1063-1kU Thrombin from human plasma
Triton X-100 Fisher BP151-500
Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm Beckman 344090
Vortex 9 to 13mm Tube Holder VWR 58816-138 Insert for vortexing flint glass tubes
Vortex Insert Retainer VWR 58816-132 Retainer needed for vortex tube holder
Vortexer VWR 2.235074 Vortex Genie 2 model G560
β-mercaptoethanol molecular biology grade Calbiochem 444203

References

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Cite This Article
Betancourt-Solis, M. A., McNew, J. A. Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays. J. Vis. Exp. (149), e59867, doi:10.3791/59867 (2019).

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