Reconstituição detergente-assistida da Drosophila atlastin recombinante em lipossomas para ensaios de mistura de lipídios

A fusão da membrana é um processo crítico em muitas reações biológicas. condições biológicas, a fusão da membrana não é espontânea e requer proteínas de fusão especializadas para catalisar tais reações¹. A fusão neutralizantes da membrana do er é negociada nos animais pelo dynamin relacionou o atlastin do GTPase². O papel da atlastin na fusão homotípica é fundamental para junções de três vias no ER periférico, que constitui uma grande rede interconectada de túbulos que se estendem por toda a célula. Atlastins têm uma morfologia conservada do domínio que consiste em um GTPase grande, em um domínio médio do pacote de três hélice, em uma escora hydrofóbica da membrana, e em um curto C-terminal cytoplasmic cauda³. Estudos in vitro com a Drosophila atlastin recombinante demonstraram que, quando reconstituídos a lipossomas, mantém as suas propriedades fusogênicas. Outros atlastins, incluindo homólogos humanos não puderam recapitular a fusão in vitro. Nós descrevemos aqui uma metodologia para purificante um GST e um poli-histidine etiquetaram o atlastin de recombinação da Drosophila, reconstituindo o aos lipossomas, e ensaio a fusão.

Estudar a fusão da membrana in vitro apresenta um desafio porque as proteínas atividade têm geralmente uma escora da membrana. A fim de estudá-los, é necessário reconstituí-los em bilayers lipídico modelo. As grandes vesículas unilamelares (LUV) são uma ferramenta útil para estudar as interações protéicas lipídicas. Apresentamos aqui um sistema para fazer LUVs de diferentes composições lipídicas para reconstituição de proteínas e ensaios de fusão. A reconstituição de proteínas integrais em LUVs pode ser alcançada por uma variedade de métodos, incluindo a reconstituição orgânica mediada por solventes, mecanismos mecânicos ou reconstituição assistida por detergente⁴. Nós apresentamos aqui um método para reconstituir o atlastin de Drosophila em lipossomas pré-formados pela remoção detergente. As vantagens deste método da reconstituição incluem rendimentos elevados da reconstituição e orientação apropriada do atlastin no bilayer do lipido. Adicionalmente, com este método, a proteína não é secada ou expor aos solventes orgânicos que mantêm desse modo a estrutura e a função. Entre suas desvantagens, a presença de detergentes pode não ser ideal para todas as proteínas e os proteoliposomas finais podem ter algum detergente incorporado na bicamada lipídica. Uma diálise adicional pode ser usada para eliminar mais do detergente. No entanto, a diálise pode demorar muito tempo e, portanto, pode levar à perda de atividade protéica.

A avaliação da atividade de fusão da atlastin pode ser determinada por ensaios de mistura lipídico como descrito anteriormente². Aqui, Delineamos um método para medir a fusão mediada por atlastina através de lipídios rotulados de N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1,3-diazol-4-YL (NBD)/lissamina RHODAMINE-B sulfonila (RHODAMINE). Este ensaio exige a fusão dos sobreviventes (etiquetados) doadores (rotulados) e do aceitador (unlabeled). Uma liberação de FRET pode ser medida durante a reação como a diluição de um par doador-aceitador de lipossomas “rotulados” para lipossomas “sem rótulo” como resultado da mistura lipídica durante a fusão da membrana (Figura 1)⁵. Quando este ensaio sere como um proxy para a fusão da membrana, é limitado em distinguir entre a fusão da membrana e o hemifusion, um estado onde somente os folhetos exteriores misturam. Para abordar este problema, uma alternativa é a têmpera de folheto externo de NBD por ditiononite. Seguindo a mesma metodologia que os ensaios de mistura de lipídeos de NBD/rhodamina, ao extinguir o folheto externo, qualquer liberação de NBD FRET por fusão será devida ao folheto interno que mistura⁸.

Ensaios alternativos de fusão por conteúdo aquoso interno misturando o endereço de fusão completa apenas⁵. Exemplos disso são os ensaios de ácido térbio (TB)/dipicolinic (DPA) e os ensaios de ácido aminonaphtaleno trisulfonico (formigas)/p-xylene bis (piridinium) (DPX). Em ensaios de TB/DPA, um conjunto de lipossomas com TB encapsulada é misturado e fundido com lipossomas com DPA encapsulado; após a fusão, a fluorescência é aumentada através da transferência de energia interna da DPA para a TB dentro do complexo de³ quelação de [TB (DPA)₃]⁶. Em contraste, para os ensaios ANTS/DPX, a fluorescência da ANTS é apagada pelo DPX⁷. Quando estes sistemas endereçam o conteúdo interno que mistura, uma preparação mais detalhada dos lipossomas é exigida para a remoção de reagentes não-encapsulados, assim como a interação não intencional dos Fluorophores.