Reinigingsmiddel-bijgestaan reconstitutie van recombinant fruit vliegje Atlastin in liposomen voor lipide-mengt analyses
Summary
De biologische membraan fusie wordt gekatalyseert door gespecialiseerde fusie proteïnen. Het meten van de fusogenic eigenschappen van eiwitten kan worden bereikt door lipide mengen assays. We presenteren een methode voor het zuiveren van recombinant fruitvliegje atlastin, een eiwit dat bemiddelt homotypic fusie van de ER, reconstitutie aan voorgevormde liposomen, en testen voor fusie capaciteit.
Abstract
Membraan fusie is een cruciaal proces in de eukaryote cel. De gespecialiseerde proteïnen zijn noodzakelijk om fusie te katalyseren. Atlastins zijn endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner eiwitten die betrokken zijn bij homotypic fusie van de ER. We detail hier een methode voor het zuiveren van een glutathion S-transferase (GST) en poly-histidine gelabeld fruitvliegje atlastin door twee rondes van affiniteitchromatografie. Het bestuderen van fusiereacties in vitro vereist gezuiverde fusie proteïnen die in een lipide bilayer moeten worden opgenomen. Liposomen zijn ideaal model membranen, zoals lipide samenstelling en de grootte kan worden aangepast. Hiertoe beschrijven we een reconstitutie methode door detergent verwijdering voor fruitvliegje atlastin in voorgevormde liposomen. Terwijl verscheidene reconstitutie methodes beschikbaar zijn, heeft de reconstitutie door detergent verwijdering verscheidene voordelen die het voor atlastins en andere gelijkaardige proteïnen geschikt maken. Het voordeel van deze methode omvat een hoge reconstitutie opbrengst en correcte richtlijn van de opnieuw samengestelde proteïne. Deze methode kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten en voor andere toepassingen die proteoliposomes vereisen. Daarnaast beschrijven we een FRET op basis van lipide mengen assay van proteoliposomes gebruikt als een meting van membraan fusie.
Introduction
Membraan fusie is een kritisch proces in veel biologische reacties. Onder biologische omstandigheden, membraan fusie is niet spontaan en vereist gespecialiseerde fusie-eiwitten om dergelijke reacties te katalyseren1. ER homotypic membraan Fusion is bemiddeld bij dieren door de dynamin gerelateerde GTPase atlastin2. Atlastin rol in homotypic Fusion is van fundamenteel belang voor drie-weg kruispunten in perifere ER, die een groot onderling verbonden netwerk van tubuli die zich uitstrekken over de hele cel vormt. Atlastins hebben een behouden domein morfologie bestaande uit een grote GTPase, een drie Helix bundel middelste domein, een hydrofobe membraan anker, en een korte cytoplasma C-Terminal staart3. In vitro studies met recombinant fruitvliegje atlastin hebben aangetoond dat wanneer het wordt hervormd tot liposomen, het zijn fusogenic eigenschappen handhaaft. Andere atlastins, met inbegrip van de menselijke homologs zijn niet in staat geweest om fusie in vitro te recapituleren. We beschrijven hier een methodologie voor het zuiveren van een GST en poly-histidine Tagged recombinant fruitvliegje atlastin, reconstitutie van het aan liposomen, en Assaying Fusion.
Studeren membraan Fusion in vitro presenteert een uitdaging als fusogenic eiwitten hebben meestal een membraan anker. Om ze te bestuderen, is het noodzakelijk om ze te reconstrueren in model lipide bilayers. De grote unilamellar blaasjes (LUV) zijn een nuttig hulpmiddel om lipide eiwitinteractie te bestuderen. Wij stellen hier een systeem voor om LUVs van verschillende lipide samenstellingen voor eiwit reconstitutie en fusie analyses te maken. Reconstitutie van integrale eiwitten in LUVs kan worden bereikt door een verscheidenheid van methoden, waaronder, organische solvent-gemedieerde reconstitutie, mechanische mechanismen, of wasmiddel bijgestaan reconstitutie4. We presenteren hier een methode voor het reconstrueren van fruitvliegje atlastin in voorgevormde liposomen door detergent verwijdering. Voordelen van deze reconstitutie methode zijn hoge reconstitutie opbrengsten en een goede oriëntatie van atlastin in de lipide bilayer. Bovendien, door deze methode, het eiwit is niet gedroogd of blootgesteld aan organische oplosmiddelen waardoor de structuur en functie. Onder zijn nadelen, kan de aanwezigheid van detergentia niet ideaal voor alle proteïnen zijn en de definitieve proteoliposomes kan één of ander verwerkt detergens in het lipide bilayer hebben. Verdere dialyse kan worden gebruikt om meer van het wasmiddel te elimineren. Echter, dialyse kan een lange tijd duren en kan dus leiden tot verlies van eiwit activiteit.
Beoordeling van atlastin fusie-activiteit kan worden bepaald door lipide mengen assays zoals eerder beschreven2. Hier schetsen we een methode voor het meten van atlastin gemedieerde fusie via N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine Rhodamine-B sulfonyl (Rhodamine) gelabeld lipiden. Deze analyse vereist fusie van donor (geëtiketteerde) proteoliposomes en Aanvaarder (ongelabelde) proteoliposomes. Een FRET release kan worden gemeten tijdens de reactie als de verdunning van een donor-accepter pair van “gelabeld” liposomen op “ongelabelde” liposomen als gevolg van lipide mengen tijdens membraan fusie (Figuur 1)5. Hoewel deze assay fungeert als een proxy voor membraan fusie, is het beperkt in het onderscheid tussen membraan fusie en hemifusion, een staat waar alleen de buitenste folders mix. Om dit probleem aan te pakken, een alternatief is buitenste brochure blussen van NBD door dithionite. Volgens dezelfde methodologie als NBD/Rhodamine lipide Mixing analyses, na het blussen van de buitenste bijsluiter elke NBD FRET release door Fusion zal te wijten zijn aan Inner folder mengen8.
Alternatieve fusie-analyses door innerlijke waterige inhoud mengen adres volledige fusie slechts5. Voorbeelden hiervan zijn terbium (TB)/dipicolinic zuur (DPA) assays en aminonaphthalene trisulfonic acid (MIERen)/p-xylene bis (Pyridinium) bromide (DPX) assays. Bij TB/DPA-assays worden een pool van liposomen met ingekapselde TB gemengd en gesmolten met liposomen met Encapsulated DPA; bij fusie wordt fluorescentie verhoogd via interne energieoverdracht van DPA naar TB binnen het [TB (DPA)3]3- chelatie complex6. In tegenstelling, voor MIERen/DPX assays, MIERen fluorescentie wordt geblust door DPX7. Hoewel deze systemen te pakken innerlijke inhoud mengen, meer diepgaande voorbereiding van liposomen is vereist voor het verwijderen van niet-ingekapseld reagentia, evenals onbedoelde interactie van de fluorophores.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methoden hier af te bakenen een efficiënte methode voor het zuiveren, reconstitutie, en het meten van fusie-activiteit van recombinant atlastin. Om hoge opbrengsten van functionele atlastin te verzekeren moeten sommige kritieke stappen worden overwogen. De uitdrukking van atlastin moet bij lage temperaturen (16 °C) worden gedaan om samenvoeging te vermijden en men zou naar een definitieve concentratie tussen 0.4 – 1.5 mg/mL moeten streven. Zeer verdund eiwit zal niet optimaal worden hervormd op een 1:400 eiwit aan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Michael Stern en zijn lab voor hun inzichten en feedback over atlastin gerelateerde projecten. Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschappen [R01GM101377] en het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
