Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Ilhotas pancreáticas liberar hormônios endócrinos para regular os níveis de glicose no sangue. Cinco tipos de células endócrinas, que diferem funcionalmente e morfologicamente, estão envolvidos neste papel essencial: α-células produzem glucagon, β-células de insulina, δ-células somatostatina, células PP polipeptídeo pancreático, e ε-células grelina¹. O perfil da expressão gênica é uma abordagem útil para caracterizar as células endócrinas em condições normais ou específicas. Historicamente, todo o perfil de expressão gênica de Islet foi gerado usando Microarray e sequenciamento de RNA de próxima geração^{2,3,4,5,6,7 , 8}. embora o transcriptoma do Islet inteiro seja informativo para identificar os transcritos órgão-específicos e os genes do candidato da doença, não descobre a heterogeneidade molecular de cada tipo da pilha do Islet. A técnica da microdissecção da captação do laser (LCM) foi aplicada para obter diretamente tipos específicos da pilha dos ilhotas^9,10,11,12 mas cai a falta da pureza da pilha alvejada População. Para superar essas limitações, a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) tem sido usada para selecionar populações específicas de células endócrinas, como as células α e β-¹³,^{14,15,16 , 17} anos de ^{, 18}. Além disso, Dorrell et al. utilizaram uma abordagem de triagem de FACS baseada em anticorpos para classificar as células β em quatro subpopulações¹⁹. As pilhas da ilhada FACS-classificadas podem igualmente ser chapeadas para arranjar em seqüência do RNA de únicas pilhas; no entanto, os métodos baseados em placa enfrentam desafios na escalabilidade^20,21,22.

Para gerar alta qualidade, dados de transcriptoma em grande escala de cada tipo de célula endócrina, aplicamos a tecnologia microfluídico a células de Illet humanas. A plataforma microfluídico gera dados de transcriptoma a partir de um grande número de células individuais em uma maneira de alta taxa de transferência, alta qualidade e escalável^{23,24,25,26,27}. Além de revelar características moleculares de um tipo de célula capturado em uma grande quantidade, a plataforma microfluídico altamente escalável permite a identificação de tipos de células raras quando são fornecidas pilhas suficientes. Assim, a aplicação da plataforma às ilhotas pancreáticas humanas permitiu o perfilamento das ε-células secretores de grelina, um tipo raro de células endócrinas com pouca função conhecida devido à sua escassez²⁸. Nos últimos anos, vários estudos foram publicados por nós e outros relatando dados de transcriptoma em larga escala de ilhotas humanas usando a tecnologia^{29,30,31,32, 33}. Os dados estão disponíveis publicamente e os recursos úteis para a Comunidade do Islet para estudar a heterogeneidade da pilha de glândula endócrina e sua implicação nas doenças.

Aqui, nós descrevemos um protocolo de sequenciamento microfluídico com base em gotas de RNA de célula única, que tem sido usado para produzir dados de transcriptomas de aproximadamente 20.000 células de ilhas humanas, incluindo α-, β-, δ-, PP, ε-Cells, e uma menor proporção de células não-endócrinas ³². o fluxo de trabalho começa com ilhotas humanas isoladas e retrata etapas de dissociação de células de ilhotas, captura de célula única e análise de dados. O protocolo requer o uso de ilhotas recém-isoladas e pode ser aplicado a ilhotas de seres humanos e outras espécies, como roedores. Usando este fluxo de trabalho, untendenciosa e abrangente Islet célula Atlas em linha de base e outras condições podem ser construídas.