Одноклеточная РНК секвенирование и анализ островков поджелудочной железы человека
Summary
Здесь мы представляем протокол для создания высококачественных, крупномасштабных транскриптомных данных одиночных клеток из изолированных островков поджелудочной железы человека с использованием капли на основе микрофлюидной одноклеточной технологии секвенирования РНК.
Abstract
Островки поджелудочной железы состоят из эндокринных клеток с отличительными шаблонами экспрессии гормонов. Эндокринные клетки показывают функциональные различия в реакции на нормальные и патологические состояния. Целью этого протокола является создание высококачественных крупномасштабных транскриптомных данных каждого типа эндокринных клеток с использованием микрофлеатной микрофлюйдной одноклеточной технологии секвенирования РНК. Такие данные могут быть использованы для создания профиля экспрессии генов каждого типа эндокринных клеток в нормальных или конкретных условиях. Этот процесс требует тщательной обработки, точного измерения и строгого контроля качества. В этом протоколе мы описываем подробные шаги для диссоциации островков поджелудочной железы человека, секвенирования и анализа данных. Репрезентативные результаты около 20 000 человек одиночных клеток-аклетов свидетельствуют об успешном применении протокола.
Introduction
Островки поджелудочной железы высвобождают эндокринные гормоны для регулирования уровня глюкозы в крови. Пять типов эндокринных клеток, которые отличаются функционально и морфологически, участвуют в этой важной роли: клетки производят глюкагон, инсулин, соматостатин, pp-клетки поджелудочной железы полипептид, и грелин1. Профилирование экспрессии генов является полезным подходом для характеристики эндокринных клеток в нормальных или специфических условиях. Исторически сложилось так, что весь вид экспрессии генов на протяжениивсего йога генерировался с помощью микроаррей и секвенирования РНК следующего поколения 2,3,4,5,6,7 , 8. Хотя весь транскриптом островка информативн для того чтобы определить орган-специфически еранты и гены кандидата заболевания, оно не сумеет расчехлить молекулярную неоднородность каждого типа клетки островка. Лазерный захват микродиссекции (LCM) техника была применена непосредственно для получения конкретных типов клеток из островков9,10,11,12, но не дотягивает до чистоты целевой клетки Населения. Для преодоления этих ограничений для выбора конкретных популяций эндокринных клеток, таких как q- и q-клетки13,14,15,16 , 17 Лет , 18. Кроме того, Dorrell et al. использовали сортированный подход на основе антител, основанный на FACS, чтобы классифицировать к-клетки на четыре субпопуляции19. Сортированные FACS аортированные абонеминированные клетки также могут быть покрыты для секвенирования РНК одиночных ячеек; однако, методы на основе пластин сталкиваются с проблемами в масштабируемости20,21,22.
Для получения высококачественных крупномасштабных транскриптомных данных каждого типа эндокринных клеток мы применили микрофлюидную технологию к островным клеткам человека. Микрофлюидная платформа генерирует транскриптомные данные из большого количества одиночных ячеек в высокой пропускной, высококачественной и масштабируемой манере23,24,25,26,27. В дополнение к выявлению молекулярных характеристик типа клеток, захваченных в большом количестве, высокомасштабируемая микрофлюидная платформа позволяет идентифицировать редкие типы клеток, когда обеспечивается достаточное количество клеток. Таким образом, применение платформы для человека островки поджелудочной железы позволило профилирования грелина-секретирования- клеток, редкий тип эндокринной клетки с малоизвестной функции из-за его дефицита28. В последние годы, несколько исследований были опубликованы нами и другими отчетности крупномасштабных транскриптомных данных человеческих островков с использованием технологии29,30,31,32, 33. Эти данные являются общедоступными и полезными ресурсами для островного сообщества для изучения неоднородности эндокринной клетки и ее последствий при заболеваниях.
Здесь мы описываем микрофлюидный протокол секвенирования РНК на основе капель, который использовался для получения транскриптомных данных примерно 20 000 островковых клеток человека, включая q-, -, q-, PP, q-cells и меньшую долю неэндокринных клеток 32. Рабочий процесс начинается с изолированных островков человека и изображает шаги диссоциации островковых клеток, одноклеточного захвата и анализа данных. Протокол требует использования свежеизолированных островков и может применяться к островкам от человека и других видов, таких как грызуны. Используя этот рабочий процесс, можно построить беспристрастный и всеобъемлющий атлас клеток на иактов в соответствии с базовыми и другими условиями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одноклеточные технологии, разработанные в последние годы, обеспечивают новую платформу для характеристики типов клеток и изучения молекулярной неоднородности островков поджелудочной железы человека. Мы приняли протокол микрофлюидной одноклеточной изоляции и анализа данных для изу…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ни один
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
- Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
- Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
- Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
- Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
