JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Published: July 18, 2019
doi:
10.3791/59866
, , , , , , ,
1Regeneron Pharmaceuticals, Inc

Summary

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Pankreas adacıklar ayırt edici hormon ifade desenleri ile endokrin hücrelerin oluşur. Endokrin hücreler normal ve patolojik koşullara yanıt olarak fonksiyonel farklılıklar gösterir. Bu protokolün amacı, her endokrin hücre türünün yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom verilerini, damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisinin kullanımı ile oluşturacaktır. Bu tür veriler, normal veya spesifik koşullarda her endokrin hücre türünün gen ifadesi profilini oluşturmak için kullanılabilir. Süreç dikkatli işleme, doğru ölçüm ve titiz kalite kontrolü gerektirir. Bu protokolde, insan pankreatik islet ayrışma, sıralama ve veri analizi için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Yaklaşık 20.000 insan tek Islet hücrelerinin temsili sonuçları protokol başarılı uygulama göstermektedir.

Introduction

Pankreas adacıklar kan şekeri düzeylerini düzenleyen endokrin hormonlar serbest. İşlevsel ve morfolojik olarak farklılık gösteren beş endokrin hücre türü, bu temel rolde yer almaktadırlar: α-hücreler glukagon, β-hücreler insülin, δ hücreleri somatostatin, PP hücreleri pankreatik polipeptid ve ε-hücreler ghrelin1. Gen ifadesi profil oluşturma, normal veya spesifik koşullarda endokrin hücrelerini karakterize etmek için yararlı bir yaklaşımdır. Tarihsel olarak, tüm Islet gen ifadesi profil oluşturma Mikroarray ve yeni nesil RNA sıralama2,3,4,5,6,7 kullanılarak oluşturuldu , 8. tüm Islet transkriptom organ özgü transkriptler ve hastalık aday genler tanımlamak için bilgilendirici olmasına rağmen, her Islet hücre türünün moleküler heterojenliği ortaya çıkarmak için başarısız olur. Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tekniği, doğrudan belirli hücre türlerini elde etmek için uygulandı9,10,11,12 ama hedeflenen hücrenin saflık kısa düşüyor Nüfus. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, α-ve β-hücreler13,14,15,16 gibi spesifik endokrin hücre popülasyonları seçmek için floresans etkin hücre sıralama (FACS) kullanılmıştır. , 17 , 18. dahası, dorrell ve ark. β-hücrelerini dört alt nüfus olarak sınıflandırmak için antikor bazlı FACS sıralama yaklaşımı kullandı19. FACS-sıralanmış Islet hücreleri de tek hücrelerin RNA sıralamaları için kaplama olabilir; Ancak, plaka tabanlı Yöntemler ölçeklenebilirlik20,21,22zorluklarla karşı karşıya.

Her endokrin hücre türünün yüksek kalitede, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için, biz insan Islet hücrelerine mikrofluidik teknoloji uygulandı. Mikrofluidik platform, yüksek verimlilik, yüksek kalitede ve ölçeklenebilir bir şekilde23,24,25,26,27gibi çok sayıda tek hücreden transkriptom veri üretir. Büyük miktarda yakalanan bir hücre türünün moleküler özelliklerini açığa çıkarmanın yanı sıra, yüksek ölçeklenebilir mikrofluidik platform, yeterli hücre sağlanırken nadir hücre türlerinin tanımlanması sağlar. Bu nedenle, insan pankreatik izletlere platformun uygulanması ghrelin-salgısı ε-hücrelerin profilleme izin, onun kıtlık nedeniyle az bilinen fonksiyon ile nadir bir endokrin hücre türü28. Son yıllarda, çeşitli çalışmalar bizim tarafımızdan yayınlandı ve diğerleri teknoloji kullanarak insan adacıklar büyük ölçekli transkriptom veri raporlama29,30,31,32, 33. Veriler, Islet topluluğunun endokrin hücre heterojenitesi ve hastalıklarında onun ima edilmesi için genel olarak kullanılabilir ve yararlı kaynaklardır.

Burada, yaklaşık 20.000 α-, β-, δ-, PP, ε-hücreler ve endokrin olmayan hücrelerin daha küçük bir kısmı gibi insan Islet hücrelerinin transkriptom veri üretmek için kullanılan bir damlacık tabanlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama protokolü, tarif 32. iş akışı yalıtılmış insan izletleri ile başlar ve Islet hücre dissociation, tek hücreli yakalama ve veri analizi adımlarını gösterir. Protokol, taze izole edilen izletlerin kullanılmasını gerektirir ve insanlar ve kemirgenler gibi diğer türlerin izletlere uygulanabilir. Bu iş akışını kullanarak, temel ve diğer koşullar altında tarafsız ve kapsamlı Islet hücre Atlası inşa edilebilir.

Protocol

1. insan Islet ayrışma Her iki cinsiyet kadavra organ bağışçıları izole insan adacıklar elde, yaş arasında 15-80 yıl, önceden mevcut hastalıklar olmadan belirli demografik ile bağış adacıklar sürece çalışma amacı için gereklidir. İzolasyondan sonra, 2-3 gün boyunca doku kültürü tesisinde izole edilmiş izletlere sahiptir. Genellikle Islet hasar görünür hale için 1 günden fazla sürer. Bir şişe içinde adacıklar yerleştirin ve tamamen Islet ortamına batı…

Representative Results

Tek hücreli RNA sıralama iş akışı üç adımda oluşur: tek hücreli süspansiyon içine bozulmamış insan izletler bunalımları, bir damlacık tabanlı teknoloji kullanarak tek hücreleri yakalamak, ve RNA-Seq verileri analiz (Şekil 1). Birincisi, elde edilen insan izletları bir gecede inkübe edildi. Bozulmamış adacıklar mikroskop altında incelenmiştir (Şekil 2a). Disanated Islet hücrelerinin bütünlüğü RNA…

Discussion

Son yıllarda geliştirilen tek hücreli teknolojiler, hücre türlerini karakterize etmek ve insan pankreatik izletlerinde moleküler heterojenliği incelemek için yeni bir platform sağlar. İnsan izletlerini incelemek için damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli yalıtım ve veri analizinin bir protokolünü kabul ettik. Protokollerimiz, 20.000 üzerinde tek insan Islet hücrelerinden, sıra kalitesi ve toplu etkilerde nispeten küçük varyasyonları olan RNA sıralama verilerini başarıyla üretti.

<p clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hiçbiri

Materials

30 µm Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 Cell strainer
8-chamber slides Chemometec 102673-680 Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 for QC
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647 Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns 10X Genomics 120237 Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) 10X Genomics 120236 Microfluidic chips
CMRL-1066 ThermoFisher 11530-037 Complete islet media
EB Buffer Qiagen 19086 Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted VWR 47744-112 Emulsion plate
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 16000-036 Complete islet media
Human islets Prodo Labs HIR Isolated human islets
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher 25030-081 Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) Illumina FC-121-1031 Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) Illumina FC-404-2005 Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140-122 Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA Kit Life Technologies Q32854 for QC
Solution 18 Chemometec 103011-420 Cell counting assay reagent
SPRISelect Reagent Fisher Scientific B23318 Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm) VWR 10861-594 for islet culture
TrypLE Express Life Technologies 12604-013 Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions VWR 77001-152 Library clean up columns
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
  36. Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
  38. Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
  39. Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).

Tags

Single-cell RNA SequencingHuman Pancreatic IsletsCell HeterogeneityRare Cell TypeGene RegulationDissociationCell SuspensionEmulsionCell CountCell ViabilityMicrofluidic Chip

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xin, Y., Adler, C., Kim, J., Ding, Y., Ni, M., Wei, Y., Macdonald, L., Okamoto, H. Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (149), e59866, doi:10.3791/59866 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image