Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d’ARN à base de gouttelettes.
Abstract
Les îlots pancréatiques se composent de cellules endocriniennes avec des modèles distinctifs d’expression d’hormone. Les cellules endocriniennes montrent des différences fonctionnelles en réponse à des conditions normales et pathologiques. L’objectif de ce protocole est de générer des données de transcriptome de haute qualité à grande échelle de chaque type de cellules endocriniennes à l’utilisation d’une technologie de séquençage microfluidique à base de gouttelettes à une seule cellule. Ces données peuvent être utilisées pour établir le profil d’expression génique de chaque type de cellule endocrinienne dans des conditions normales ou spécifiques. Le processus nécessite une manipulation minutieuse, une mesure précise et un contrôle rigoureux de la qualité. Dans ce protocole, nous décrivons des étapes détaillées pour la dissociation, le séquençage, et l’analyse de données des îlots pancréatiques humains. Les résultats représentatifs d’environ 20 000 cellules d’îlet sinispeules humaines démontrent l’application réussie du protocole.
Introduction
Les îlots pancréatiques libèrent des hormones endocriniennes pour réguler les niveaux de glucose dans le sang. Cinq types de cellules endocriniennes, qui diffèrent fonctionnellement et morphologiquement, sont impliqués dans ce rôle essentiel : les cellules de l’apo, produisent du glucagon, de l’insuline des cellules, de la somatostatine des cellules PP, du polypeptide pancréatique et de la ghrélinedescellules de l’apo 1. Le profilage de l’expression génique est une approche utile pour caractériser les cellules endocriniennes dans des conditions normales ou spécifiques. Historiquement, l’ensemble du profilage de l’expression génique des îaux a été généré à l’aide du microréseau et du séquençage de l’ARN de nouvelle génération2,3,4,5,6,7 , 8. Bien que le transcriptome entier d’îtte soit instructif pour identifier les transcriptions d’organe-spécifiques et les gènes candidats de maladie, il ne découvre pas l’hétérogénéité moléculaire de chaque type de cellule d’îtal. La technique de microdissection de capture de laser (LCM) a été appliquée pour obtenir directement des types de cellules spécifiques des îlots9,10,11,12 mais manque la pureté de la cellule visée population. Pour surmonter ces limitations, le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) a été utilisé pour sélectionner des populations de cellules endocriniennes spécifiques, telles que les cellules de l’aétée et des cellules13,14,15,16 , 17 Annonces , 18. De plus, Dorrell et coll. ont utilisé une approche de tri FACS à base d’anticorps pour classer les cellules de l’A en quatre sous-populations19. Les cellules d’échafaudaise fac-triées de FACS peuvent également être plaquées pour le séquençage d’ARN des cellules simples ; cependant, les méthodes à base de plaques font face à des défis dans l’évolutivité20,21,22.
Pour générer des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle de chaque type de cellule endocrinienne, nous avons appliqué la technologie microfluidique aux cellules humaines d’isfle. La plate-forme microfluidique génère des données de transcriptome à partir d’un grand nombre de cellules individuelles dans un haut débit, de haute qualité, et de manière évolutive23,24,25,26,27. En plus de révéler les caractéristiques moléculaires d’un type de cellule capturée en grande quantité, plate-forme microfluidique hautement évolutive permet d’identifier les types de cellules rares lorsque suffisamment de cellules sont fournies. Par conséquent, l’application de la plate-forme aux îlots pancréatiques humains a permis le profilage des cellules de la ghréline-sécrétion, un type de cellules endocriniennes rares avec la fonction peu connue due à sa rareté28. Ces dernières années, plusieurs études ont été publiées par nous et d’autres rapportant des données de transcriptome à grande échelle des îlots humains utilisant la technologie29,30,31,32, 33. Les données sont accessibles au public et des ressources utiles pour la communauté des îîaux pour étudier l’hétérogénéité des cellules endocriniennes et son implication dans les maladies.
Ici, nous décrivons un protocole de séquençage microfluidique à base de gouttelettes d’ARN unicellulaire, qui a été utilisé pour produire des données de transcriptome d’environ 20 000 cellules d’isfle-d’œil humain, y compris des cellules d’isflement, y compris des cellules non endocriniens, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniens, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non en 32. Le flux de travail commence par des îlots humains isolés et représente des étapes de dissociation des cellules des îlots, de capture d’une seule cellule et d’analyse des données. Le protocole exige l’utilisation d’îlots fraîchement isolés et peut être appliqué aux îlots de l’homme et d’autres espèces, comme les rongeurs. À l’aide de ce flux de travail, un atlas de cellules d’islet impartial et complet dans des conditions de référence et d’autres conditions peut être construit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les technologies unicellulaires développées ces dernières années fournissent une nouvelle plate-forme pour caractériser les types de cellules et étudier l’hétérogénéité moléculaire dans les îlots pancréatiques humains. Nous avons adopté un protocole d’isolement microfluidique à base de gouttelettes unicellulaire et d’analyse de données pour étudier les îlots humains. Notre protocole a produit avec succès des données de séquençage de l’ARN à partir de plus de 20 000 cellules d’ists humains uniques …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
aucun
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
- Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
- Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
- Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
- Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
