תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.
Abstract
איונים הלבלב מהווים תאים אנדוקריניים עם דפוסי ביטוי הורמונים ייחודיים. התאים האנדוקריניים מציגים הבדלים פונקציונליים בתגובה לתנאים נורמליים ופתולוגיים. המטרה של פרוטוקול זה היא להפיק נתונים באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של כל סוג תא האנדוקרינית עם שימוש של מיקרופלואידיc מבוססי-droplet המבוססת על טכנולוגיית הרצף RNA של תא יחיד. נתונים אלה יכולים להיות מנוצל כדי לבנות את הפרופיל ביטוי גנים של כל סוג תא האנדוקרינית בתנאים נורמליים או ספציפיים. התהליך דורש טיפול זהיר, מדידה מדויקת ובקרת איכות קפדנית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים מפורטים עבור האדם הלבלב, ברצף וניתוח נתונים. תוצאות הנציג של כ 20,000 האדם תאים איון יחיד להפגין את היישום המוצלח של הפרוטוקול.
Introduction
איולי הלבלב לשחרר הורמונים אנדוקרינית לווסת את רמות הגלוקוז בדם. חמישה סוגי תאים אנדוקרינית, אשר שונים מבחינה פונקציונלית מורפולוגית, מעורבים תפקיד חיוני זה: α-תאים לייצר glucagon, β-תאים אינסולין, δ-תאים סוסטטין, PP תאים הלבלב polypeptide, ו ε-תאים גרלין1. ביטוי גנטי פרופיל הוא גישה שימושית כדי לאפיין את התאים האנדוקרינית בתנאים נורמליים או ספציפיים. היסטורית, כל ביטוי גנים איון פרופיל נוצר באמצעות microarray הדור הבא RNA רצף2,3,4,5,6,7 , 8. למרות איון שלם ההמרה הוא אינפורמטיבי כדי לזהות את האיבר הספציפי האיברים המועמדים גנים המועמד, זה לא מצליח לחשוף את טרוגניות המולקולרי של כל סוג תא איון. לכידת לייזר מיקרודיסקציה (lcm) טכניקה הוחל ישירות להשיג סוגי תאים ספציפיים מ איי9,10,11,12 אבל נופל קצר של טוהר התא ממוקד אוכלוסייה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, מיון תאים פלואורסצנטית המופעל (facs) נעשה שימוש כדי לבחור אוכלוסיות מסוימות של תאים אנדוקריניים, כגון α-ו β-תאים13,14,15,16 , מיכל בן 17 , 18. יתר על כן, dorrell ואח ‘ השתמשו בגישה המבוססת על נוגדן מיון facs לסווג β תאים לארבע אוכלוסיות משנה19. FACS-מיון תאים איון יכול גם להיות מצופה עבור רצפי RNA של תאים בודדים; עם זאת, השיטות המבוססות על הצלחת מתמודדות עם אתגרים במדרגיות20,21,22.
כדי להפיק באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול נתונים הטרנססקריפט של כל סוג תא האנדוקרינית, אנו להחיל את הטכנולוגיה microfluidic לתאי איון האדם. פלטפורמת microflu, c מייצרת נתונים משני מספר גדול של תאים בודדים בתפוקה גבוהה, באיכות גבוהה ובצורה מדרגית,23,24,25,26,27. בנוסף חשיפת המאפיינים המולקולריים של סוג תא שנלכד בכמות גדולה, פלטפורמת microflu, מדרגיים במיוחד מאפשר זיהוי של סוגי תאים נדירים כאשר מספיק תאים מסופקים. מכאן, יישום של הפלטפורמה לאיונים הלבלב האנושי מותר על הפרופיל של ghrelin-הפרשה ε-תאים, סוג תא האנדוקרינית נדיר עם מעט הידוע בגלל המחסור שלה28. בשנים האחרונות, מספר מחקרים פורסמו על ידינו ואחרים מדווחים על נתונים בקנה מידה גדול של האיים האנושיים באמצעות טכנולוגיה29,30,31,32, 33. הנתונים הם זמינים לציבור משאבים שימושיים עבור הקהילה איון לחקור טרוגניות התא האנדוקרינית ואת המשתמע שלה במחלות.
כאן, אנו מתארים droplet-מבוססי מיקרופלואידיג המבוסס על פרוטוקול RNA, אשר שימש להפקת נתונים transcript של כ 20,000 תאים איון האדם כולל α-, β-, δ-, PP, ε-תאים, ושיעור קטן יותר של תאים שאינם אנדוקריניים 32. זרימת העבודה מתחיל עם איונים אנושיים בודדים ומתאר צעדים של דיסוציאציה תא איון, לכידת תא יחיד, ניתוח נתונים. הפרוטוקול דורש שימוש באיונים מבודדים טריים וניתן להחילם על איונים של בני אדם ומינים אחרים, כגון מכרסמים. באמצעות זרימת עבודה זו, משוחדת ואת האטלס התא המקיף איון תחת הבסיסית ותנאים אחרים ניתן לבנות.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכנולוגיות חד-תאי שפותחו בשנים האחרונות מספקות פלטפורמה חדשה לאפיון סוגי תאים וטרוגניות מולקולרית לחקר באיים הלבלב האנושי. אימצנו פרוטוקול של מיקרופלואידיג בידוד תא בודד וניתוח נתונים כדי ללמוד איונים אנושיים. הפרוטוקול שלנו הפיק בהצלחה נתונים רצפי RNA של למעלה מ 20,000 תאים איון יחיד האדם ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
לא
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
- Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
- Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
- Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
- Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
