JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Published: July 18, 2019
doi:
10.3791/59866
, , , , , , ,
1Regeneron Pharmaceuticals, Inc

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.

Abstract

Pancreatic eilandjes bestaan uit endocriene cellen met onderscheidende hormoon expressie patronen. De endocriene cellen vertonen functionele verschillen in reactie op normale en pathologische omstandigheden. Het doel van dit protocol is het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van elk type endocriene cellen met het gebruik van een druppeltje gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie. Dergelijke gegevens kunnen worden gebruikt om het genexpressie profiel van elk type endocriene cellen in normale of specifieke omstandigheden te bouwen. Het proces vereist zorgvuldige hantering, nauwkeurige meting en strenge kwaliteitscontrole. In dit protocol beschrijven we gedetailleerde stappen voor de dissociatie, sequencing en data-analyse van menselijke alvleesklier eilandjes. De representatieve resultaten van ongeveer 20.000 humane single Islet-cellen tonen de succesvolle toepassing van het protocol aan.

Introduction

Pancreatic eilandjes vrijgeven endocriene hormonen om de niveaus van de glucose van het bloed te reguleren. Vijf endocriene celtypen, die functioneel en morfologisch verschillen, zijn betrokken bij deze essentiële rol: α-cellen produceren glucagon, β-cellen insuline, δ-cellen Somatostatine, pp-cellen alvleesklier polypeptide en ε-cellen ghreline1. Genexpressie profilering is een nuttige benadering om de endocriene cellen in normale of specifieke omstandigheden te karakteriseren. Historisch gezien werd het hele eilandje genexpressie profilering gegenereerd met behulp van Microarray en volgende-generatie RNA-sequencing2,3,4,5,6,7 , 8. Hoewel het hele eilandje transcriptome informatief is om de Orgaanspecifieke transcripten en kandidaatgenen van de ziekte te identificeren, slaagt het er niet in de moleculaire heterogeniteit van elk eilandje celtype te achterhalen. Laser Capture microdissection (LCM)-techniek is toegepast om rechtstreeks specifieke celtypen te verkrijgen van eilandjes9,10,11,12 maar valt niet op zuiverheid van de beoogde cel Bevolking. Om deze beperkingen te overwinnen, is fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt om specifieke endocriene celpopulaties te selecteren, zoals α-en β-cellen13,14,15,16 , 17 , 18. Bovendien gebruikte dorrell et al. een op antilichamen gebaseerde FACS Sorteer benadering om β-cellen te classificeren in vier subpopulaties19. FACS-gesorteerde eiland cellen kunnen ook worden verguld voor RNA-sequencing van enkelvoudige cellen; de op plaat gebaseerde methoden worden echter geconfronteerd met uitdagingen in schaalbaarheid20,21,22.

Voor het genereren van hoge kwaliteit, grootschalige transcriptome gegevens van elk type endocriene cel, we toegepast microfluïdische technologie voor menselijke eiland cellen. Het microfluïdische platform genereert transcriptome gegevens uit een groot aantal afzonderlijke cellen in een hoge doorvoer, hoge kwaliteit en schaalbare manier23,24,25,26,27. Naast het onthullen van moleculaire kenmerken van een celtype dat in een grote hoeveelheid is gevangen, maakt een zeer schaalbaar microfluïdisch platform identificatie van zeldzame celtypen mogelijk wanneer er voldoende cellen worden geleverd. Vandaar dat de toepassing van het platform op menselijke pancreas eilandjes de profilering van ghrelin-afscheidende ε-cellen toegestaan, een zeldzaam endocriene celtype met weinig bekende functie vanwege zijn schaarste28. In de afgelopen jaren, verschillende studies zijn gepubliceerd door ons en anderen rapporteren grootschalige transcriptome gegevens van menselijke eilandjes met behulp van de technologie29,30,31,32, 33. De gegevens zijn publiekelijk beschikbaar en nuttige middelen voor de Gemeenschap van het eiland om de heterogeniteit van de endocriene cellen en de implicatie ervan bij ziekten te bestuderen.

Hier beschrijven we een op droplet gebaseerd microfluïdisch single-cell RNA sequencing protocol, dat is gebruikt om transcriptome gegevens te produceren van ongeveer 20.000 menselijke eilandje cellen, waaronder α-, β-, δ-, PP, ε-cellen, en een kleiner deel van niet-endocriene cellen 32. de werkstroom begint met geïsoleerde menselijke eilandjes en toont stappen van eilandje celdissociatie, vastleggen in één cel en gegevensanalyse. Het protocol vereist het gebruik van vers geïsoleerde eilandjes en kan worden toegepast op eilandjes van mensen en andere soorten, zoals knaagdieren. Met behulp van deze workflow, kunnen onbevooroordeelde en uitgebreide eiland-celatlas onder baseline en andere omstandigheden worden gebouwd.

Protocol

1. dissociatie van menselijke eilandje Verkrijgen van menselijke eilandjes geïsoleerd van kadaver orgaandonoren van beide geslacht, leeftijden tussen 15-80 jaar, zonder reeds bestaande ziekten, tenzij eilandjes van donoren met specifieke demografische gegevens zijn vereist voor het doel van de studie. Na isolatie, hebben de geïsoleerde eilandjes bewaard in de weefselcultuur faciliteit voor 2-3 dagen bij de leverancier. Het duurt vaak meer dan 1 dag voor eilandje schade zichtbaar te worden. …

Representative Results

De single-cell RNA sequencing workflow bestaat uit drie stappen: door intact menselijke eilandjes in eencellige suspensie, het vastleggen van afzonderlijke cellen met behulp van een druppel gebaseerde technologie, en het analyseren van RNA-SEQ-gegevens (Figuur 1). Ten eerste werden de verworven menselijke eilandjes ‘s nachts geïnfiltreerd. De intacte eilandjes werden onder de microscoop onderzocht (Figuur 2a). De integriteit van…

Discussion

Single-cell technologieën ontwikkeld in de afgelopen jaren bieden een nieuw platform te karakteriseren celtypen en studie moleculaire heterogeniteit in menselijke alvleesklier eilandjes. We hebben een protocol van op droplet gebaseerde microfluïdische eencellige isolatie en data-analyse aangenomen om menselijke eilandjes te bestuderen. Ons protocol heeft met succes RNA-sequentie gegevens geproduceerd van meer dan 20.000 single human Islet-cellen met relatief kleine variaties in sequentie kwaliteit en batch-effecten.</p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Geen

Materials

30 µm Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 Cell strainer
8-chamber slides Chemometec 102673-680 Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 for QC
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647 Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns 10X Genomics 120237 Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) 10X Genomics 120236 Microfluidic chips
CMRL-1066 ThermoFisher 11530-037 Complete islet media
EB Buffer Qiagen 19086 Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted VWR 47744-112 Emulsion plate
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 16000-036 Complete islet media
Human islets Prodo Labs HIR Isolated human islets
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher 25030-081 Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) Illumina FC-121-1031 Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) Illumina FC-404-2005 Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140-122 Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA Kit Life Technologies Q32854 for QC
Solution 18 Chemometec 103011-420 Cell counting assay reagent
SPRISelect Reagent Fisher Scientific B23318 Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm) VWR 10861-594 for islet culture
TrypLE Express Life Technologies 12604-013 Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions VWR 77001-152 Library clean up columns
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
  36. Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
  38. Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
  39. Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).

Tags

Single-cell RNA SequencingHuman Pancreatic IsletsCell HeterogeneityRare Cell TypeGene RegulationDissociationCell SuspensionEmulsionCell CountCell ViabilityMicrofluidic Chip

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xin, Y., Adler, C., Kim, J., Ding, Y., Ni, M., Wei, Y., Macdonald, L., Okamoto, H. Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (149), e59866, doi:10.3791/59866 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image