マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の定量化

すべての動物実験は、倫理当局の承認を必要とします。 1. 大動脈のマウスの犠牲と微小解剖 CO2窒息と記録重量によってマウスを犠牲にする。 サンプルの毛皮の汚染を避けるために70%のエタノールでマウスをスプレーします。マウスをサフィンの位置に置きます。ジャグラーノッチから、マヨハサミを使って中線切開を行い、ほとんど恥骨まで伸ばします。注意:高い割合のエタノールは非常に可燃性であり、深刻な眼刺激を引き起こす可能性があります。予防措置を講じる。 23Gの針を使用して、胸壁を通して心臓穿刺によってマウスを吐き出します。この手順は、通常、20週齢のマウスから750 μLの血液を得る。典型的には、三カリウムEDTAコーティングチューブで体積の半分を収集し、残りの半分を血清またはリチウムヘパリンコーティングチューブに入れます。チューブをそっと回し、さらに処理するまで室温に保ちます。 マヨはさみを使用して、腹腔を開くために中線の頭頂腹膜を切断します。組織鉗子でxiphoidプロセスを保持し、両側に腹膜を横に開き、横隔膜を開き、横隔膜を開き続けます。 マヨはさみを使用して、可能な限り横に肋骨ケージを切断して胸腔を開きます。これは、後で大断を微細分解しながら、楽器のための広い角度を可能にします。 灌流液の排水のための右の耳の切開を作る。頭蓋方向に心臓の頂点を通して27 Gの針を挿入します。少なくとも2分の間に10 mLの冷たいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でマウスをゆっくりと浸透させながら、左心室に針を固定しておきます。注:一部のプロトコルはパラホルムアルデヒド灌流を使用しますが、これはリンパ球の免疫組織化学分析など、いくつかの下流アプリケーションを妨げる。したがって、パラホルムアルデヒドを用いる灌流固定は、このプロトコルでは行われなかった。 解剖鉗子を使用して、目的の器官(例えば、リンパ節、脾臓、肝臓、腸、鼠径脂肪パッド、腎臓など)を解剖し、はさみを解剖する。 大動脈のアーチを傷つけることなく、心臓の右側の気管と食道を切り取る。内臓を後腹膜に付着させる横隔膜と構造を切断し、心臓、大様、腎臓をその中に残します。肺と内臓を慎重に折りたたみ、ナプキンで覆い、大動脈下リンパ節および腹部大動脈の後腹膜微小切除を開始する。 6倍の倍率で立体顕微鏡下で微小解剖を開始します。デュモン鉗子で周囲の組織を持ち上げ、ヴァンナスのはさみで緊張の下で切断することにより、大動脈分岐を解剖し始めます。 腹部大動脈の解剖を頭蓋骨に続ける。大動脈から腹部の枝を切り取り、横隔膜の大動脈を通して大動脈を近位に解放する。注:微小断分断は、ステレオ顕微鏡を介して正確な手と目のコーディネーションを必要とし、マスターするにはいくつかの練習が必要です。 胸部大胸を覆う脂肪組織を取り除く。慎重に枝で大動脈のアーチを解放するために胸腺の後部を解剖します。胸腔内で頸動脈を可能な限り遠位に解剖し続ける。特別な場合には、頸部の分岐を含むように頸部解剖を行うことができる。 脱イオン水、RNase除染液、70%エタノール、PBSで連続的なすすびで機器をきれいにしてから、実際に大腸を切断します。鉗子で頂点によって心臓を持ち上げます。心臓の近くに大小管をカットし、PBSとチューブに全体の心臓を置きます。心臓は、大動脈根の処理と凍結を続ける前に、数時間氷の上に保存することができます。 図 1Aに従って大動脈のアーチを切る。4°Cで一晩4%ホルムアルデヒドの1 mLを含むチューブに大動脈アーチを入れます。試料は、ピン留めと分析の前に数年間、この方法で保存することができます。注意:ホルムアルデヒドは、癌、アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があり、飲み込むと有害です。必要に応じて個人用保護具を使用してください。 残りの降下大管を解剖し、RNA安定化溶液に入れたり、その後のRNA分析やその他の用途のために凍結をスナップします。解剖時間を最小限に抑えるために作業フローを最適化することは、過度のRNA劣化を避けるために重要です。 血液採取管(ステップ1.3で収集)を遠心分離機に入れます。室温で15分間、別々のプラズマと血清管を1,500 x gでスピンダウンします。プラズマと血清をマイクロ遠心管に慎重に移し、-80°Cで保存します。EDTAおよびヘパリン化された血漿または血清の両方を集めることは、複数の下流アプリケーションの可能性を残します。 心臓をコルクベッドの上に置き、腹部を上に向けて置きます。頂点を通して針でコルクに心臓を固定します。解剖鉗子で心臓の基盤を握る。 メスを使用して、矢状面で20°の矢状に20°の矢状に傾斜した2つの聴覚との間の線としてカットの方向を持つ心臓の頂点2/3を切り取ります(図1B)。 大動脈根を最適な切断温度(OCT)化合物に埋め込み、周囲を囲むが、組織に浸透しない。心臓の基部をOCT化合物に浸します。大動脈根をOCTで満たし、気泡を取り除くために鉗子で心臓をそっと絞ります。 OCTで満たされたクライムオールドの底に標本を移します。大動脈根は、底面に対して垂直にする必要があります。取り付けた心臓をドライアイスに入れて凍らせます。このプロトコルのセクション3に従って凍結切除を追求するまで、-80 °Cでジップロックバッグに標本を保管してください。 図1:その中の心臓と大動脈のアーチ。(A) 肺、気管、食道、胸腺を除去し、20週齢の雌アポー-/-マウスを顕微鏡写真で通常のチョウダイエットに表示するために、スケールバー=2mmを表示する。点線は、大動脈のアーチとその枝をカットする場所を示します。(B) 心臓と大器の概略図。赤の点線は、大動脈根を凍結する前に心臓を切る場所を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 2. 大動脈アーチとブラキオケファリック動脈の顔解析 大動脈アーチの顔解析用のピン留めベッドを準備します。平らな25mm x 25mmの表面を作るためにパラフィンワックスフィルムのセグメントを8回折ります。黒い電気絶縁テープで包んで、大通りの暗い背景を作ります。ピン留めベッドの裏側にラベルを貼り、鉛筆を使用してマウス識別番号を書きます(通常のペンインクは染色プロセスで消えます)。 大動脈のアーチをピン留めベッドに移し、その上にPBSの滴を置きます。立体顕微鏡下で残りの体脂肪組織から大歯の洗浄を開始します。 大げさや損傷を与えることなく、周囲のすべての脂肪組織を優しく剥離するには、ヴァンナスのはさみとデュモン鉗子を使用してください。スーダンIVは脂肪組織を明るく染色し、この時点ですべてのそのような組織を除去することが重要です。注:必要に応じて、常に追加のPBSを適用して大小間を湿らせておいてください。 大動脈内の大動脈を切り開き、大動脈内のバンナスはさみを導入して、親密な表面を露出させます。遠位方向に上昇アーチの外側の曲率をカットし、上皮動脈を含む枝を開き続けます。下降胸部領域の後部をスペアします。 より小さい曲率を切り開き、大曲を折りたたんで親密な表面を表示します。注:このステップは、細かい運動能力を必要とし、習得するためにいくつかの練習を必要とします。 ミヌチン昆虫ピンの鈍い端を使用して、ピン留めベッドに開いているアーチをピン留めします。マイクロカストロビエホ針ホルダーを使用してピンを所定の位置に置きます。ピンを所定の位置に置くとき、試料からそっと曲げます。試料を伸ばさずにベッドの上に大器を平らに固定します。4 °CでPBSで満たされたペトリ皿に下向きにピン留めアーチを格納します。注:プロトコルはここで一時停止できます。 スーダンIVの作業ソリューションを準備します。スーダンIV粉末1g、70%エタノールの100mL、アセトン100mLをダークボトルに混ぜ、10分間静かにかき混ぜます。溶液をフィルタリングする必要はなく、室温で暗く保たれた場合、数ヶ月間使用することができます。染色色が満足できない場合は、新しい溶液を作り、試料を再び染色することができます。注意:アセトンは、深刻な目の刺激を引き起こす可能性のある可燃性の液体です。換気の良い場所に保管し、取り扱い時には予防措置を講じてください。 ラボベンチに5つのペトリ皿を配置します:1つは70%のエタノールで満たされ、1つはスーダンIV作業溶液で満たされ、2つは80%のエタノールで満たされ、もう1つはPBSで満たされています。 最初のペトリ皿にピン留めベッドを下向きにして、70%のエタノールで試料を5分間すすいでから始めます。試料をスーダンIV作動液に移し、アーチを7分間染色させる。 次に、80%エタノールを3分間3分間すすいで、正常な親密な表面を脱染させる。デステイン時間を調整して、結果を最適化できます。最後に、元のペトリ皿に標本を戻す前にPBSですすいでください。 デジタルカメラに接続された倍率10倍の立体顕微鏡を使用して顕微鏡を取得します。小さな金属の重量(20 mm x 10 mm x 5 mm)を使用してPBSに沈んだピン留めされたアーチの写真を撮り、ペトリ皿の底にピン留めベッドを保持します。イメージのキャリブレーションのために、大王の横にルーラーを配置します。 画像解析ソフトウェア(例:ImageJ)を使用して、病変面積と全面面を決定します。大動脈のアーチを定義する解剖学的ランドマークが欠如している場合、測定は通常、上昇大動脈の始まりから最初の肋間枝まで行われます(図2A)。ソフトウェアの面積定量機能を使用して、合計インティマル アーチ領域を手動で囲みます。注:病変定量は盲目的な方法で行われるべきであり、2番目の研究者が結果を確認することをお勧めします。 ImageJ で、ポリゴン選択ツールを選択し、繰り返しクリックして合計アーチ面積を囲みます。次に、分析メニューでメジャーを選択し、結果ウィンドウに合計アーチ領域を表示します。 次に、アーチ内のすべてのスーダンIV染色プラークを囲みます。スーダンIVは、脂質、トリグリセリド、リポタンパク質をオレンジ赤色で染色するリソクロムジアゾ色素です。ImageJ で、フリーハンド選択ツールを選択し、Alt キーを押しながらすべてのプラークを囲みます。分析メニューのメジャーをクリックすると、病変のないアーチ領域が結果ウィンドウに表示されます。 負傷のない領域を合計アーチ領域から差し引き、結果を合計アーチ面積で除算して、相対病変領域を計算します。 鎖骨下動脈と頸動脈を注意深くピン留めし、上皮吸止め動脈における病変定量を可能にする(図2A)。鎖骨下動脈および一般的な頚動脈の病変の定量化は、通常、非常に困難であり、それぞれ意味がない。 ImageJ では、シフト キーを押しながらポリゴン選択ツールを使用して、両側頭動脈の両方の部分を囲みます。分析メニューのメジャーをクリックすると、結果ウィンドウに全ブラキオセファリック動脈領域が表示されます。 次に、フリーハンド選択ツールを選択し、Alt キーを押しながら、ブラキオケファリック動脈のすべてのプラークを囲みます。分析メニューのメジャーをクリックして、病変のないブラキオセファリック動脈領域を結果ウィンドウに表示します。 全ブラキオセファリック動脈領域から病変のない領域を差し引き、その結果を全ブラキオエファリック動脈領域で除算して、相対病変領域を計算します。 図2:アテローム硬化性病変定量。(A) 20週齢の雄ヒトAPOB100-トランスジェニックLdlr -/-(HuBL)マウスから大動脈アーチを10週間食べさせ、スーダンIVを用いた脂質が豊富なプラークに対して開いて染色した。 総大動脈アーチ表面積は、顕微鏡写真の白色点線で輪郭を描き、スケールバー = 2 mm です。黄色の点線は、ブラキオセファリック動脈の全表面積を概説します。(B)20週齢の雄Ldlr-/-マウスは、顕微鏡写真で可視化された8週間の西洋食を、スケールバー=500μmで大動脈性大動脈内生から400μmで供給した。 黒の点線は、全血管面積と動脈内膜に局在するオイルレッドOで染色されたアテローム硬化性病変の輪郭を描く。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 3. 大動脈根の凍結切除 クライオスタット温度を-20 °C に設定し、断面の厚さを 10 μm に設定します。切断を開始する間、試料ホルダーに平行になるように断面の位置合わせを微調整します。 折り目のないセクションを簡単に収集するように、周囲のOCTを過度に取り除きます。心臓の基部が金型に正しく配置されたことを考えると、大動脈根はナイフブレードに垂直に配置される必要があります。 廃棄される通常の顕微鏡スライド上の初期制御セクションを収集します。最初のセクションは、唯一の心筋組織を含む必要があります.その時点で断面を 200 μm 進めてください。セクションを収集し、光顕微鏡で進行状況を確認します。 左心室の流出路に近づくと、顕微鏡下で100μmごとに確認してください。容器壁の初期徴候が観察されるとき、50 μmにペースを遅くする。注:最初の大動脈カスプが表示されると、これはセクションを収集するためのポイント 0 になります。カスプがいつ正確に現れるかを見るのは難しいかもしれませんが、同じ領域の病変の比較を行うには正確なローカリゼーションが重要です。 標本をポイントゼロカスプに向かって傾けて、断面平面を他の 2 つのカスプに合わせます。これは、大断の真の断面を得るために重要です。大動脈根の描画を作成し、カスプが現れることを示し、ポイント 0 以降にカットされた 10 μm セクションごとにカウントします。 2番目のカスプが現れたら、試料をカスプからもう一度傾けて、標本を3番目のカスプに合わせます。カスプ間のレベル差は50 μmを超えてはなりません。 図 3のスライド計画に従ってセクションを収集します。大動脈根が50μmを超える場合は、190μmからセクションの収集を開始し、さらにスペースを空けてルートを直線的な位置に整列させることができるようにする。ポイントゼロから800 μmのレベルに達するまで断面を続けます。このレベルで目に見えるプラークがまだある場合、コレクションは 1,000 μm に拡張できます。注:簡略化されたスライドの編成を補足図 1に示します。最適なスライド計画は、プロジェクト計画に応じて決定する必要があります。 収集後のセクションを修正します。 このプロトコルのセクション4を追求するまで、脱イオン水、乾燥、および室温で10分間4%ホルムアルデヒドでコラーゲンのオイルレッド染色とピクロシリウス赤染色のために収集されたセクションを修正します。スライドがすぐにオイルレッドOで染色し、まだ濡れている場合は、乾燥プロセスをスピードアップするために1分間60%イソプロパノールに入れます。注意:イソプロパノールは、深刻な目の刺激を引き起こす可能性があり、眠気やめまいを引き起こす可能性がある可燃性の液体です。換気の良い場所に保管し、取り扱い時には予防措置を講じてください。 氷冷純粋なアセトンで免疫組織化学または免疫蛍光のために収集したセクションを10分間、室温で30分間乾燥させ、-20°Cの店舗セクションを固定します。 図 3: 大動脈根のシリアルセクションのスライドの編成。上昇大動脈の最初の800 μmにまたがる10 μmの厚さのセクションごとに大動脈根の凍結切除の間に収集されるべきである。さまざまなアプリケーションに適したセクションを取得するには、体系的なスライド組織が必要です。病変組成物の分析には、通常、脂質に対するオイルレッドO染色およびコラーゲン用のピロシリウス赤染色が含まれる。残りのセクションは、免疫組織化学および免疫蛍光染色のためにアセトン固定を収集し、固定する。この図は、Gisterå et al30から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 4. 大動脈根におけるアテローム性動脈硬化症の油赤色染色と定量 イソプロパノールの100mLにオイルレッドOの1gを溶解することにより飽和オイルレッドO溶液を調出します。室温で1時間暗いボトルで溶液をかき混ぜます。飽和溶液は、数ヶ月間保持することができます。注:溶液に接触した機器の洗浄が困難なため、オイルレッドO染色用の実験装置を指定することをお勧めします。 飽和オイルレッドO溶液の75mLを50mLの脱イオン水と混合して作業溶液を調作する。定性フィルターペーパーを通して10分間室温に立たせてください。 スライドをオイルレッドO作動液に20分間水道水に入れ、5分間使用します。 組織の視覚化を支援するために、5分間ぬるま湯でメイヤーのヘマトキシリンで1分間染色します。すべての核は、青色で染色する必要があります, 結果を最適化するために染色時間を調整. 水性取り付け媒体(例えば、カイザーのグリセロールゼラチン)にスライドを取り付ける。ウォームカイザーのグリセロールゼラチンを40°Cにして、使用前に流体にします。取り付け媒体は水ベースであるため、スライドを乾燥させる必要はありません。カバーガラスを追加する際は、気泡の形成を避けるように注意してください。注意:カイザーのグリセロールゼラチンにはフェノールが含まれており、遺伝的欠陥を引き起こす可能性があります。必要に応じて個人用保護具を使用してください。 光顕微鏡に接続されたカメラを使用してデジタル顕微鏡を取得します。通常、完全な血管壁と病変境界は、50倍の倍率で明確に視覚化することができます。高解像度の画像を保存します(できれば、タグ付き画像ファイル形式(TIFF))。 コンピュータ支援画像解析ソフトウェアシステムを用いて病変サイズの解析を行う。オイルレッドOは、中性脂質を染色し、強い赤色でアテローム硬化性プラークを可視化するリソクロムジアゾ色素であり、病変定量を支援します。注:病変定量は盲目的な方法で行われるべきであり、第二の研究者が得られた結果を確認することをお勧めします。 画像解析ソフトウェアの面積定量機能を使用して、大動脈血管壁の外部弾性積水を囲むことで全血管面積を定義します(図2B)。ImageJ で、ポリゴン選択ツールを選択し、繰り返しクリックして領域を囲みます。次に、分析メニューでメジャーを選択します。船舶の合計面積が結果ウィンドウに表示されます。 内部弾性層および明面境界によって定義される血管の内皮層におけるアテローム硬化性病変を定量し続ける。通常、弁カスプ上の病変は測定27から除外される。ImageJ で、フリーハンド選択ツールを選択し、Alt キーを押しながらすべてのプラークを囲みます。分析メニューでメジャーを選択し、結果ウィンドウに病変のない血管領域を表示します。 全血管面積から病変のない面積を差し引き、その結果を合計容器面積で除算して、相対病変面積を計算します。注:平方マイクロメートルで絶対病変領域を得るために使用される倍率に従って画像解析ソフトウェアで結果を校正します。 画像解析ソフトウェアの色しきい値機能を使用して、病変領域全体のオイルレッド O 陽性面積のパーセンテージを計算して、病変のオイル レッド O 染色領域を定義します。 ImageJ では、シフトキーを押しながらフリーハンド選択ツールを使用して、すべての病変領域を囲みます。分析メニューで測定を選択して、結果ウィンドウに病変領域の合計を表示します。 編集メニューで[外側をクリア]を選択します。イメージの種類をイメージ メニューの 8 ビットに変更します。 画像メニューの調整サブメニューでしきい値を選択して、オイルレッドO負の領域に赤いしきい値を設定します。[適用] をクリックします。プロセス メニューのバイナリ サブメニューでこのオプションを選択して、イメージをバイナリにします。注:通常、オイルレッドO染色はバッチ間で変化する。したがって、色のしきい値は、同じ染色バッチ内でのみ推奨されます。結果は、しきい値がどのように決定され、標準化されたかを説明するとともに表示する必要があります。 分析メニューでパーティクルの分析を選択して画像を分析し、[OK] をクリックします。オイルレッドO負の病変領域の合計がサマリーウィンドウに表示されるようになりました。相対オイルレッドO正の面積を計算するには、オイルレッドO負の領域を合計病変面積から差し引き、合計病変面積で除算します。