نماذج مورين من تصلب الشرايين هي أدوات مفيدة للتحقيق في المسارات المسببة للأمراض على المستوى الجزيئي، ولكن تتطلب قياس اقاصي موحد لتطوير الآفات. يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة لتحديد حجم الآفة في الأوعية الشريانية الرئيسية بما في ذلك الجذر الأبهري والقوس الأبهري والشريان البشعي.
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم. السبب الأساسي في معظم الحالات هو تصلب الشرايين، وهو في جزء منه مرض التهابي مزمن. وقد أوضحت الدراسات التجريبية تصلب الشرايين دور الكوليسترول والالتهاب في عملية المرض. وقد أدى هذا إلى تجارب سريرية ناجحة مع العوامل الصيدلانية التي تقلل من المظاهر السريرية لتصلب الشرايين. يمكن للتجارب المتأنية والخاضعة للرقابة جيدا في نماذج الماوس من المرض مزيد من توضيح مسببات الأمراض من المرض، وهو أمر غير مفهوم تماما. تحليل الآفات موحدة من المهم للحد من التباين التجريبي وزيادة استنساخ. تحديد حجم الآفة في الجذر الأبهري، والقوس الأبهري، والشريان البعية هي نقاط النهاية الشائعة في تصلب الشرايين التجريبية. يوفر هذا البروتوكول وصفًا تقنيًا لتقييم تصلب الشرايين في جميع هذه المواقع في ماوس واحد. ويفيد البروتوكول بشكل خاص عندما تكون المواد محدودة، كما هو الحال في كثير من الأحيان عندما يتم وصف الحيوانات المعدلة وراثيا.
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم مع أمراض القلب الإقفارية والسكتة الدماغية التي تمثل واحدة من كل أربع وفيات1. تحدث معظم الحالات بسبب تصلب الشرايين، وهو مرض يتميز بتراكم بطيء لللويحات المحملة بالدهون مع علامات الالتهاب المزمن في الشرايين الكبيرة والمتوسطة الحجم2. يبقى المرض عادة دون أن يلاحظها أحد على مدى عدة عقود حتى تمزق أو تآكل البلاك يثير تجلط الشرايين الذي يؤدي إلى تلف الأنسجة الإقفارية.
يتكون الشريان الطبيعي من طبقة إنتيما مع الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء الموزعة بشكل ضئيل، وطبقة وسائل الإعلام مع خلايا العضلات الملساء وlamellae مرنة، وطبقة adventitial المحيطة مع النسيج الضام فضفاضة3. الاحتفاظ بالقيمة العلفية من LDL يعوض تطور تصلب الشرايين4. تراكم وتعديل البروتينات الدهنية يؤدي إلى التجميع والفخ داخل intima الشرياني5. ويثير استجابة التهابية من قبل البروتينات الدهنية المحاصرين والمعدلة6. الخلايا البطانية تبدأ في التعبير عن جزيئات التصاق، مثل VCAM-1 في مواقع في شجرة الشرايين مع تدفق الدمالمضطرب، مما يؤدي إلى تجنيد الخلايا الأحادية المتداولة وغيرها من الكريات البيض 7. الخلايا الأحادية المتسللة تميز إلى الضامة التي تغمر الدهون مع التحول الذي أعقب ذلك إلى خلايا رغوة الضامة8.
وقد درست تصلب الشرايين في نماذج الماوس مع زيادة وتيرة منذ منتصف الثمانينات. C57BL/6 هو سلالة الماوس الأصيلة الأكثر استخداما لهذه الدراسات، ويستخدم كخلفية وراثية لغالبية السلالات المعدلة وراثيا9. تأسست هذه السلالة في101920 ، ونشرت جينومها في عام 200211. التجارب في نماذج الماوس لها العديد من الفوائد: المستعمرات تتكاثر بسرعة، والإسكان هو الفضاء كفاءة، والتوالد يقلل من التباين التجريبي. ويسمح النموذج أيضا بالتلاعب اتّهاب اتّساهية وراثيّة، مثل حذف الجينات المستهدفة وإدراج الجينات المتحولة. وقد أدى هذا إلى فهم جديد للأمراض الفسيولوجية للمرض وأهداف العلاج الجديد12.
الفئران من النوع البري C57BL/6 مقاومة طبيعية لتصلب الشرايين. لديهم معظم الكولسترول المتداول في HDL، ولا يتم تشكيل الآفات المعقدة تصلب الشرايين حتى عندما تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون والكوليسترول العالي13. الفئران ارتفاع الكوليسترول، مثل Apoe-/- على C57BL/6-الخلفية، وبالتالي تستخدم كنماذج تجريبية من تصلب الشرايين14،15. عدم وجود ApoE يضعف التناول الكبدي من البروتينات الدهنية المتبقية ويزعج بشدة التمثيل الغذائي للدهون. في Apoe-/- الفئران، والكوليسترول المتداولة هو في الغالب في جزيئات VLDL، والفئران تطوير لويحات تصلب الشرايين معقدة على نظام غذائي تشاو العادية.
Ldlr-/- الفئران تحاكي تطور تصلب الشرايين ينظر في البشر مع ارتفاع الكوليسترول العائلي16. ال [لورد]-/- يحتاج فأرات غربيّة نوع حمية أن يطوّر تصلب الشرايين17. النظام الغذائي الغربي يحاكي تناول الطعام البشري وعادة ما يحتوي على الكوليسترول 0.15٪. مستقبلات LDL يعترف ApoB100 وApoE وتوسط في تناول جزيئات LDL من خلال بطانة الرحم. مستقبلات LDL أساسية لإزالة الكبد من LDL من الدورة الدموية، في حين أن التعبير مستقبلات LDL في الخلايا المكونة للدم لا يؤثر على هذه العملية. وهذا يفتح إمكانية زرع نخاع العظم من خلايا Ldlr+/+ إلى اللاوسير الكولسترول الزائد -/- المتلقين وتقييم تطور تصلب الشرايين. وقد استخدمت عادة chimeras نخاع العظام لدراسة مشاركة الخلايا المكونة للدم في تصلب الشرايين التجريبية. ومع ذلك، يمكن أن يؤثر زرع نخاع العظام على حجم وتكوين لويحات تصلب الشرايين، مما يجعل تفسير النتائج غامضاً.
وقد تم تطوير متغيرات مختلفة من Apoe-/- وLdlr-/- الفئران مع تغييرات وراثية إضافية لدراسة عمليات محددة من المرض18. ومن الأمثلة على ذلك الفئران البشرية APOB100-المعدلة وراثيا ً Ldlr -/- (HuBL) التي تحمل جين APOB100 البشري الكاملالطول 19و20. هذه الفئران تطوير ارتفاع الكوليسترول في الدم وتصلب الشرايين على نظام غذائي تشاو العادية. ومع ذلك، فإن تطوير لويحات تصلب الشرايين المعقدة يستغرق ما لا يقل عن ستة أشهر والبروتوكولات التجريبية أقصر عادة ما تستخدم النظام الغذائي الغربي21. يتم تداول جزء كبير من الكوليسترول في البلازما في جزيئات LDL، مما يعطي الفئران HuBL أكثر الإنسان مثل البروتين الدهني مثل الإنسان مقارنة مع Apoe-/- وLdlr -/- الفئران. الفئران HuBL تسمح أيضا دراسات apoB الإنسان كمستضد ذاتي22.
نماذج الماوس من تصلب الشرايين تطوير لويحات تصلب الشرايين معقدة مع السمات المشتركة للمرض البشري. ومع ذلك، فإن لويحات مقاومة إلى حد ما لتمزق مع احتشاء عضلة القلب التي تلت ذلك. يتم الكشف عن Atherothrombosis فقط بشكل متقطع وتحديا تجريبيا لتقييم23،24،25. وقد وضعت نماذج خاصة من تمزق البلاك، ولكن المجال التجريبي يفتقر إلى نموذج موثوق واستنساخ لتقييم عوامل استقرار البلاك.
وقد تم الإبلاغ عن القياس الكمي لتصلب الشرايين بطرق عديدة في الأدب. وقد حاولت الجهود الأخيرة توحيد التصميم التجريبي، والتنفيذ، والإبلاغ عن الدراسات الحيوانية26. وللمحققين أفضليات وتقنيات مختلفة تتكيف مع مختبراتهم. كما أن معظم المشاريع البحثية فريدة من نوعها بطريقة تتطلب بعض التعديلات البروتوكولية. بسبب الطبيعة المتعددة العوامل للمرض ، تختلف الضوابط المثلى بين المشاريع. وقد تتسبب الظروف المحلية وعدم التوحيد القياسي في حدوث اختلافات ملحوظة في تطور الأمراض، مما يعوق التقدم في مجال البحوث. وتعني الاختلافات في التغير التجريبي أيضا أن حسابات الطاقة الإحصائية ينبغي أن تستند إلى دراسات تجريبية في ظل الظروف المحلية.
ينصح بالقياس الكمي لتصلب الشرايين في عدة مواقع في شجرة الأوعية الدموية. يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على نتائج من الجذر الأبهري، والقوس الأبهري، والشريان البشّيق في فأر واحد، بالإضافة إلى ترك بقية الشريان الأبهري البطني للتحليلات الأخرى. في مواجهة الاستعدادات تسمح التحديد الكمي السريع لللويحات المحملة بالدهون في القوس الأبهري. يمكن أيضًا تحديد عبء المرض في الشريان العضدي الرأسي كمياً إذا تم عرض العينات بعناية. أكثر تستغرق وقتا ً طويلاً المقطع العرضي للجذر الأبهري يترك عدة أقسام متاحة للتقييم التفصيلي لتكوين البلاك.
أمراض القلب والأوعية الدموية هو القاتل الرئيسي في العالم وهناك حاجة إلى قياسات وقائية جديدة2. نماذج الماوس من المرض توفر منصة شاملة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية والعلاجات التجريبية13. يمكن الاعتماد عليها حجم الآفة القياس الكمي ضروري لهذا النهج. غير أن أساليب القياس الكمي تختلف بين المختبرات. التوحيد والتحسين كانت عملية مستمرة منذ 198013،27،33،34. ظهرت جذور الأبهر كالموقع الأكثر شعبية لتحديد كمية تصلب الشرايين التجريبية. تتيح المقاطع العرضية من اللويحات مقارنة حجم البلاك بين المجموعات. ويفضل En الاستعدادات الوجه للقياس الكمي الآفة في قطاعات أكبر من الأبهر. طريقة أون الوجه تصور كمية البلاك وتمكن من القياس الكمي لتغطية منطقة البلاك، ولكن لا تأخذ سمك البلاك في الاعتبار. وتُدعم الأهمية البيولوجية للاختلافات الملاحظة بنتائج متسقة في مواقع مختلفة في شجرة الأوعية الدموية. تقييم تطوير تصلب الشرايين في مواقع مختلفة يعالج الآثار المحتملة للموقع. يمكن تقييم تأثير الخلايا المكونة للدم المزروعة على تطور تصلب الشرايين في اللاوسير ة فرط الكوليسترول -/- تشيميراس. ومع ذلك، يؤثر التشعيع لكامل الجسم على عملية تصلب الشرايين مع تأثيرات محددة للموقع. يتم تطوير الآفات التصلب الشرايين أكثر بروزا في الجذر الأبهري ، في حين لوحظ انخفاض تطور الآفة في الأقواس الأبهرية35.
الأهم من ذلك، ليس فقط حجم الآفة يحتاج إلى معالجة في دراسات تصلب الشرايين التجريبية. تكوين الآفة هو أيضا معلمة رئيسية. وقد ارتبطت العديد من ملامح البلاك مع مظاهر المرض في البشر36. المقطع التسلسلي للجذر الأبهري يترك عدة أقسام متاحة لتحليل دقيق لتكوين البلاك. يتميز تمزق البلاك في البشر بغطاء ليفي رفيع مع عدد قليل من خلايا العضلات الملساء، ومحتوى الكولاجين المتناثر وعلامات الالتهاب في لويحات36. على الرغم من أن تمزق البلاك هو حدث نادر في نماذج الماوس من تصلب الشرايين، وعلامات لاستقرار البلاك هي مفيدة لتقييم. يمكن للنهج المترجمة تأكيد النتائج الميكانيكية من نماذج الماوس وكشف السمات الهامة للأمراض البشرية31. يمكن تحديد الحالة الالتهابية لللويحات تصلب الشرايين عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية من VCAM-1، MHC الفئة الثانية، الضامة، والخلايا الليمفاوية30. بعض البروتوكولات استخدام المقاطع الطولية في الطائرة الإكليلية من القوس الأبهري أو الشريان الصدري لقياس حجم الآفة تصلب الشرايين وتكوين37. ومع ذلك، يترك هذا الأسلوب البديل مقاطع قليلة فقط لتحليلها، مما يحد من تطبيقاته.
وتتمثل الخطوة الحاسمة الأولية في هذا البروتوكول في القدرة على حصاد الأبهر بكفاءة. التنسيق بين اليد والعين تحت المجهر يتطلب الممارسة وهو أمر بالغ الأهمية لكل من الاستئصال الجزئي والغزل اللاحق للقوس الأبهري. الخطوة الهامة التالية في هذا البروتوكول هي مجموعة المقاطع التسلسلية من الجذر الأبهري. وينبغي جمع ثمانين قسما ً متتالياً لكل فأر، الأمر الذي يتطلب التركيز والصبر على حد سواء. ويمكن أن تؤدي الكفاءة المنهجية إلى تسريع العمليات الموصوفة إلى حد كبير. ومع ذلك، لا يزال تحديد كمية الآفات تصلب الشرايين مهمة تستغرق وقتا طويلا. قد تسهل التكنولوجيا الجديدة والمناولة الآلية والتصوير الحيواني الصغير التحديد الكمي لتصلب الشرايين التجريبية في المستقبل. تطور تصلب الشرايين بطيء ومعظم البروتوكولات التجريبية في نماذج الماوس يستغرق أكثر من أربعة أشهر لإكمال13. لذلك، يجب جمع الأبهر بطريقة مثلى في نقاط نهاية الدراسة. يوفر هذا البروتوكول دليلشامل لحصاد الأبهر بكفاءة، كما أن المعالجة المقترحة تعد الأبهر للاستخدام متعدد الأغراض بما في ذلك تحديد كمية الآفات في الجذر الأبهري والقوس الأبهري والشريان البعية. نأمل أن البروتوكول يمكن أن تقلل من التباين التجريبي، وتعزيز موثوقية النتائج، ويؤدي إلى نتائج من شأنها أن تمهد الطريق لعلاجات جديدة ضد تصلب الشرايين.
The authors have nothing to disclose.
نشكر جميع الأعضاء السابقين في وحدة أبحاث القلب والأوعية الدموية التجريبية في غوران ك هانسون التي ساعدت في تطوير هذا البروتوكول على مدى ربع القرن الماضي. ونحن ممتنون بصفة خاصة للمساهمات التي قدمها أنتونيو نيكوليتي، وشينغهوا تشو، وآنا كارين روبرتسون، وإينغر بودين. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة المشروع 06816 ودعم Linnaeus 349-2007-8703 من مجلس البحوث السويدي، ومن خلال منح من مؤسسة القلب والرئة السويدية، ومجلس مقاطعة ستوكهولم، ومؤسسة البروفيسور نانا سفارتز، ولو وهانز أوسترمان مؤسسة البحوث الطبية، مؤسسة بحوث معهد كارولينسكا ومؤسسة أمراض الشيخوخة في معهد كارولينسكا.
Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | – | To create pinning beds for aortic arches. |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
Cork board | Any specialized retailer | – | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
Deionized water | – | – | For rinsing and preparation of solutions. |
Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
ImageJ | NIH | – | Image analysis software. |
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
Petri dishes (100×20 mm) | Any cell culture supplier | – | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
Phosphate buffered saline (PBS) | – | – | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |