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Immunology and Infection

Quantificazione dell'aterosclerosi nei topi

Published: June 12, 2019
doi:
10.3791/59828
, , ,
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine,Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine,University of Southern Denmark (SDU)

Summary

I modelli Murine di aterosclerosi sono strumenti utili per studiare le vie patogene a livello molecolare, ma richiedono una quantificazione standardizzata dello sviluppo delle lesioni. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per determinare le dimensioni della lesione nei vasi arteriosi principali, tra cui la radice aortica, l’arco aortico e l’arteria brachiocefalica.

Abstract

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nel mondo. La causa sottostante nella maggior parte dei casi è l’aterosclerosi, che è in parte una malattia infiammatoria cronica. Studi sperimentali sull’aterosclerosi hanno chiarito il ruolo del colesterolo e dell’infiammazione nel processo della malattia. Questo ha portato a sperimentazioni cliniche di successo con agenti farmaceutici che riducono le manifestazioni cliniche di aterosclerosi. Esperimenti accurati e ben controllati nei modelli murini della malattia potrebbero ulteriormente chiarire la patogenesi della malattia, che non è pienamente compresa. L’analisi standardizzata delle lesioni è importante per ridurre la variabilità sperimentale e aumentare la riproducibilità. Determinare le dimensioni della lesione nella radice aortica, nell’arco aortico e nell’arteria brachiocefalica sono endpoint comuni nell’aterosclerosi sperimentale. Questo protocollo fornisce una descrizione tecnica per la valutazione dell’aterosclerosi in tutti questi siti in un unico topo. Il protocollo è particolarmente utile quando il materiale è limitato, come spesso accade quando si caratterizzano gli animali geneticamente modificati.

Introduction

La malattia cardiovascolare è la principale causa di morte nel mondo con cardiopatia ischemica e ictus che rappresentano uno ogni quattro morti1. La maggior parte dei casi sono causati da aterosclerosi, una malattia caratterizzata da un lento accumulo di placche cariidi con segni di infiammazione cronica nelle arterie di grandi e medie dimensioni2. La malattia di solito rimane inosservata per diversi decenni fino a quando una rottura o un’erosione della placca provoca una trombosi arteriosa che porta a danni ai tessuti ischemici.

Un’arteria normale è costituita da uno strato di intimità con cellule endoteliali e cellule muscolari lisce scarsamente distribuite, uno strato multimediale con cellule muscolari lisce e lamelline elastiche e uno strato avvenivitale circostante con tessuto connettivo sciolto3. Una ritenzione intima di LDL compensa lo sviluppo dell’aterosclerosi4. L’accumulo e la modifica delle lipoproteine portano all’aggregazione e all’intrappolamento all’interno dell’intima arteria5. Una risposta infiammatoria è evocata dalle lipoproteine intrappolate e modificate6. Le cellule endoteliali iniziano ad esprimere molecole di adesione, come VCAM-1 nei siti dell’albero arterioso con flusso sanguigno turbolento, portando al reclutamento di monociti circolanti e altri leucociti7. I monociti infiltranti si differenziano in macrofagi che inghiottiscono i lipidi con la conseguente trasformazione in cellule di schiuma di macrofalo8.

L’aterosclerosi è stata studiata in modelli murini con frequenza crescente dalla metà degli anni ’80. C57BL/6 è il ceppo di topo inbred più comunemente usato per questi studi, ed è usato come sfondo genetico per la maggior parte dei ceppi geneticamente modificati9. Questo ceppo è stato istituitonel 10 del 1920 e il suo genoma è stato pubblicato nel 200211. Gli esperimenti sui modelli murini hanno diversi vantaggi: le colonie si riproducono velocemente, l’alloggiamento è efficiente per lo spazio e l’inbreeding riduce la variabilità sperimentale. Il modello consente anche manipolazioni genetiche, come le delezioni genetiche mirate e l’inserimento di transgeni. Questo ha portato a una nuova comprensione patofisiologica della malattia e a nuovi obiettivi terapeutici12.

I topi C57BL/6 di tipo selvatico sono naturalmente resistenti all’aterosclerosi. Hanno la maggior parte del colesterolo circolante in HDL, e le lesioni aterosclerotiche complesse non si formano anche quando alimentato una dieta ad alto contenuto di grassi e alto colesterolo13. I topi ipercolesterolemici, come Apoe-/- sul c57BL/6-background, sono quindi utilizzati come modelli sperimentali di aterosclerosi14,15. La mancanza di ApoE implichi l’assorbimento epatico delle lipoproteine rimanenti e perturba gravemente il metabolismo dei lipidi. Nei topi Apoe-/-, il colesterolo circolante è prevalentemente nelle particelle di VLDL, e i topi sviluppano placche aterosclerotiche complesse su una dieta di chow regolare.

Ldlr-/- topi imitano lo sviluppo di aterosclerosi visto negli esseri umani con ipercolesterolemia familiare16. I topi Ldlr-/- hanno bisogno di una dieta di tipo occidentale per sviluppare l’aterosclerosi17. La dieta occidentale imita l’assunzione di cibo umano e di solito contiene 0,15% colesterolo. Il recettore LDL riconosce ApoB100 e ApoE e media l’assorbimento delle particelle LDL attraverso l’endocitosi. Recettori LDL sono fondamentali per la clearance del fegato di LDL dalla circolazione, mentre l’espressione del recettore LDL nelle cellule ematopoietiche non influenza questo processo. Questo apre la possibilità di trapianto di midollo osseo di cellule Ldlrin ldlr ipercolesterolemico -/- destinatari e valutazione dello sviluppo dell’aterosclerosi. Le chimere del midollo osseo sono state comunemente utilizzate per studiare la partecipazione delle cellule ematopoietiche nell’aterosclerosi sperimentale. Tuttavia, il trapianto di midollo osseo potrebbe influenzare le dimensioni e la composizione delle placche aterosclerotiche, rendendo ambigua l’interpretazione dei risultati.

Diverse varianti di Apoe-/- e Ldlr-/- topi con ulteriori alterazioni genetiche sono state sviluppate per studiare processi specifici della malattia18. Un esempio sono i topi umani APOB100-Transgenic Ldlr-/- (HuBL) che portano il gene APOB100 umano a tutta lunghezza19,20. Questi topi sviluppano ipercolesterolemia e aterosclerosi su una dieta di chow regolare. Tuttavia, lo sviluppo di placche aterosclerotiche complesse richiede almeno sei mesi e protocolli sperimentali più brevi di solito usano la dieta occidentale21. Una grande frazione di colesterolo plasmatico sta circolando nelle particelle di LDL, il che conferisce ai topi HuBL un profilo di lipoproteina dilipidemia più simile all’uomo rispetto ai topi Apoe-// e Ldlr-/. I topi HuBL permettono anche studi di apoB umano come autoantigen22.

I modelli murini dell’aterosclerosi sviluppano placche aterosclerotiche complesse con caratteristiche condivise della malattia umana. Tuttavia, le placche sono abbastanza resistenti alla rottura con conseguente infarto miocardico. L’aterothrombossi è solo spettralmente rilevata e sperimentalmente difficile valutare23,24,25. Sono stati sviluppati modelli speciali di rottura della placca, ma il campo sperimentale manca di un modello affidabile e riproducibile per la valutazione degli agenti stabilizzanti della placca.

La quantificazione dell’aterosclerosi è stata riportata in molti modi nella letteratura. Recenti sforzi hanno cercato di standardizzare la progettazione sperimentale, l’esecuzione e la segnalazione di studi sugli animali26. I ricercatori hanno preferenze e tecniche diverse adattate ai loro laboratori. La maggior parte dei progetti di ricerca sono anche unici in un modo che richiedono alcune modifiche di protocollo. A causa della natura multifattoriale della malattia, i controlli ottimali variano da un progetto all’altro. Le condizioni locali e la mancanza di standardizzazione possono causare differenze osservate nello sviluppo della malattia, che ostacola i progressi del campo della ricerca. Le differenze nella variabilità sperimentale significano anche che i calcoli statistici della potenza devono basarsi su studi pilota in condizioni locali.

La quantificazione dell’aterosclerosi è raccomandata in diverse posizioni dell’albero vascolare. Questo protocollo descrive come ottenere risultati dalla radice aortica, dall’arco aortico e dall’arteria brachiocefalica in un singolo topo, oltre a lasciare il resto dell’aorta toracodedominale per altre analisi. I preparati en face consentono una rapida quantificazione delle placche cariche di lipidi nell’arco aortico. Il carico di malattia nell’arteria brachiocefalo può anche essere quantificato se gli esemplari sono accuratamente visualizzati. La sezione trasversale della radice aortica che richiede più tempo lascia diverse sezioni disponibili per una valutazione dettagliata della composizione della placca.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali richiedono l’approvazione da parte delle autorità etiche. 1. Sacrificio del topo e microdisezione di Aorta Sacrificare il topo per asfissia CO2 e peso record. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo per evitare la contaminazione da pelliccia dei campioni. Posizionare il mouse in una posizione supina. Dalla tacca giugulare, fare un’incisione mediana utilizzando le forbici Mayo estendendolo quasi fino all’osso pubico.ATTENZIONE: L’etanolo ad alta percentuale è altamente infiammabile e potrebbe causare gravi irritazioni agli occhi. Adottare misure precauzionali. Utilizzare un ago 23 G per essanguinare il topo da foratura cardiaca attraverso la parete torace. Questa procedura di solito produce 750 l. di sangue da un topo di 20 settimane. In genere, raccogliere metà del volume in un tubo rivestito in EDTA a tri-potassio e l’altra metà in un siero o tubo rivestito di elio di elio. Ruotare delicatamente i tubi e tenerli a temperatura ambiente fino a ulteriori elaborazioni. Utilizzare le forbici Mayo per tagliare il peritoneo parietale nella linea mediana per aprire la cavità addominale. Tenere il processo xifoide con pinze tissutali e tagliare il peritoneo lateralmente su entrambi i lati e continuare ad aprire il diaframma. Utilizzare le forbici Mayo per aprire la cavità toracica tagliando attraverso la gabbia toracica il più lateralmente possibile. Ciò consentirà ampi angoli per gli strumenti durante il microdissecing dell’aorta in un secondo momento. Fare un’incisione nel auricolo destro per il drenaggio del liquido perfusione. Inserire un ago da 27 G attraverso l’apice del cuore in direzione cranica. Mantenere l’ago fissato nel ventricolo sinistro mentre lentamente perfusione del mouse con 10 mL ghiaccio-freddo fosfato-bufferato salina (PBS) durante almeno 2 min. Osservare il fegato spostando di colore e diventando più pallido. NOT:</ Alcuni protocolli usano la perfusione paraformaldeide, ma questo interferisce con diverse applicazioni a valle, come l’analisi immunostochimica dei linfociti. Pertanto, nessuna fissazione perfusione con paraformaldeide viene eseguita in questo protocollo. Organi dissetati di interesse (ad esempio linfonodi, milza, fegato, intestino, cuscinetti di grasso inguinale, reni, ecc.) utilizzando pinze anatomiche e forbici sezionate. Tagliare trachea ed esofago sul lato destro del cuore senza danneggiare l’arco aortico. Tagliare il diaframma e le strutture attaccando le viscere al retroperitoneo, lasciando il cuore, l’aorta e i reni in situ. Piegare via i polmoni e viscera caudalmente e coprirli con un tovagliolo per iniziare la microdissezione retroperitoneale di linfonodi para-aortici e aorta addominale. Iniziare la microdissezione sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 6x. Inizia a sezionare la biforcazione aortica sollevando il tessuto circostante con le pinze Dumont e tagliando sotto tensione con le forbici Vannas. Continuare la dissezione dell’aorta addominale cranicamente. Tagliare i rami addominali dall’aorta e liberare l’aorta prosimmetricamente attraverso la pausa aortica nel diaframma. NOT:</ La microdissezione richiede un’accurata coordinazione occhio-mano attraverso lo stereomicroscopio, che richiede una certa pratica per padroneggiare. Rimuovere il tessuto adiposo che copre l’aorta toracica. Sezionare con attenzione dorsalmente del timo per liberare l’arco aortico con rami. Continuare a sezionare le arterie carotidee il più dissuaso possibile nella cavità toracica. In casi particolari, la dissezione del collo potrebbe essere eseguita per includere la biforcazione carotide. Pulire gli strumenti con risciacqui consecutivi in acqua deionizzata, soluzione di decontaminazione RNase, 70% etanolo e PBS prima di tagliare effettivamente l’aorta. Sollevare il cuore dall’apice con le pinze. Tagliare l’aorta vicino al cuore e posizionare l’intero cuore in un tubo con PBS. Il cuore potrebbe essere conservato sul ghiaccio per un paio d’ore prima di continuare l’elaborazione e criomontare la radice aortica. Tagliare l’arco aortico secondo la Figura 1A. Mettere l’arco aortico in un tubo contenente 1 mL di 4% formaldeide durante la notte a 4 gradi centigradi. Il campione potrebbe essere conservato in questo modo per diversi anni prima di pinning e analisi.ATTENZIONE: La formaldeide può causare cancro, reazioni cutanee allergiche, ed è dannosa se instata. Utilizzare dispositivi di protezione personale come richiesto. Dissezionare l’aorta discendente rimanente e metterlo in una soluzione di stabilizzazione dell’RNA o snap congelarlo per la successiva analisi dell’RNA o altra applicazione. Ottimizzare il flusso di lavoro per ridurre al minimo il tempo di dissezione è fondamentale per evitare un’eccessiva degradazione dell’RNA. Mettere i tubi di raccolta del sangue (raccolti al punto 1.3) in una centrifuga. Girare verso il basso il plasma separato e tubi del siero a 1.500 x g per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire con cura il plasma e il siero nei tubi di microcentrismo e conservare a -80 gradi centigradi. La raccolta di plasma o siero eparanied EDTA e eparinizzato lascia possibilità per molteplici applicazioni a valle. Posizionare il cuore su un letto di sughero con il lato ventrale rivolto verso l’alto. Fissare il cuore al tappo con un ago attraverso l’apice. Tenere la base del cuore con pinze anatomiche. Utilizzare un bisturi per tagliare l’apicale 2/3 del cuore con la direzione del taglio essendo come una linea tra i due auricoli con il bisturi angolato 20 caudally nel piano sagittale e 20o cranialmente nel piano trasversale (Figura 1B). Incorporare la radice aortica in composto di temperatura di taglio ottimale (OCT), che circonda, ma non infiltrarsi nel tessuto. Immergi la base del cuore nel composto dello Strumento di personalizzazione di Office. Stringere delicatamente il cuore con le pinze per riempire la radice aortica con OCT e rimuovere eventuali bolle d’aria. Trasferire il campione sul fondo di un criomold riempito con OCT. La radice aortica dovrebbe ora essere perpendicolare alla superficie inferiore. Mettere il cuore montato sul ghiaccio secco per congelare. Conservare gli esemplari in sacchetti di chiusura a cerniera in -80 gradi centigradi fino a quando non inseguono la criosezione secondo la sezione 3 di questo protocollo. Figura 1: Cuore e arco aortico in situ. (A) I polmoni, la trachea, l’esofago e il timo vengono rimossi per visualizzare l’arco aortico in situ in una femmina di 20 settimane femmina Apoe-/- mouse sulla dieta di chow regolare in un micrografo, barra della scala 2 mm. Le linee tratteggiate indicano dove tagliare l’arco aortico e i suoi rami. (B) Una rappresentazione schematica del cuore e dell’aorta. La linea tratteggiata in rosso indica dove tagliare il cuore prima di criomontare la radice aortica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 2. En Face Analisi dell’Arco Aortico e dell’Arteria Brachiocefalica Preparare i letti pinning per l’analisi en face degli archi aortici. Piegare un segmento di pellicola di cera di paraffina otto volte per creare una superficie piatta di 25 mm x 25 mm. Avvolgerlo con nastro isolante elettrico nero per fare uno sfondo scuro per l’aorta. Posizionare un’etichetta sul retro del letto di pinning e utilizzare una matita di piombo per scrivere il numero di identificazione del mouse (inchiostro penna normale scomparirà nel processo di colorazione). Trasferire l’arco aortico al letto di pinning e posizionare una goccia di PBS su di esso. Iniziare a pulire l’aorta dal restante tessuto adiposo periadventizio sotto uno stereomicroscopio. Utilizzare forbici Vannas e pinze Dumont per rimuovere delicatamente tutto il tessuto adiposo circostante senza manipolare o danneggiare l’aorta. Il Sudan IV macchia il tessuto adiposo brillantemente ed è fondamentale rimuovere tutto questo tessuto a questo punto. NOT:</ Mantenere l’aorta umido in ogni momento applicando PBS aggiuntivo quando necessario. Tagliare l’aorta nel piano coronale introducendo le forbici Vannas nel lume aortico per esporre la superficie intima. Iniziare a tagliare la curvatura esterna dell’arco ascendente in direzione dissina e continuare a tagliare i rami tra cui l’arteria brachiocefalica. Risparmiare la parte dorsale della regione toracica discendente. Tagliare aprire la curvatura minore e piegare l’aorta per visualizzare la superficie intima. NOT:</ Questo passaggio richiede abilità motorie e ha bisogno di un po ‘di pratica per padroneggiare. Pin l’arco aperto al letto a puntura utilizzando l’estremità smussata di perni di insetti minuti. Utilizzare un supporto aghi micro Castroviejo per mettere i perni in posizione. Piegare delicatamente i perni lontano dal campione quando in posizione. Pin l’aorta piatta sul letto senza allungare l’esemplare. Conservare l’arco appuntato rivolto verso il basso in un piatto Petri pieno di PBS a 4 gradi centigradi. NOT:</ Il protocollo può essere messo in pausa qui. Preparare una soluzione di lavoro del Sudan IV. Mescolare 1 g di sudanesi IV in polvere, 100 mL di 70% etanolo e 100 mL di acetone in una bottiglia scura e mescolare delicatamente per 10 min. Non c’è bisogno di filtrare la soluzione e può essere utilizzato per un paio di mesi se mantenuto buio a temperatura ambiente. Se il colore di colorazione non è soddisfacente, una nuova soluzione può essere fatta e gli esemplari macchiati di nuovo.ATTENZIONE: L’acetone è un liquido infiammabile che potrebbe causare gravi irritazioni agli occhi. Conservare in un luogo ben ventilato e adottare misure precauzionali durante la manipolazione. Disporre cinque piatti Petri sul banco del laboratorio: uno riempito con il 70% di etanolo, uno riempito con soluzione di lavoro Sudan IV, due riempiti con l’80% di etanolo e uno pieno di PBS. Iniziare con il risciacquo dell’esemplare nel 70% di etanolo per 5 min posizionando il letto di pinning nella prima piastra Petri con l’arco rivolto verso il basso. Trasferire il campione alla soluzione di lavoro Sudan IV e lasciare macchiare l’arco per 7 min. Successivamente, risciacquare in 80% etanolo per 3 min due volte per destare la normale superficie intima. Il tempo di destaining potrebbe essere regolato per ottimizzare i risultati. Infine, risciacquare in PBS prima di rimettere il campione nel piatto Petri originale. Acquisire micrografie utilizzando uno stereomicroscopio a 10 volte l’ingrandimento collegato a una fotocamera digitale. Scattare foto dell’arco appuntato sommerso in PBS utilizzando piccoli pesi metallici (20 mm x 10 mm x 5 mm) per tenere il letto di pinning sul fondo di una piastra Petri. Posizionare un righello accanto all’aorta per la calibrazione dell’immagine. Utilizzare un software di analisi delle immagini (ad esempio ImageJ) per determinare l’area di lesione e la superficie intima totale. In mancanza di punti di riferimento anatomici per definire l’arco aortico, la misurazione viene di solito eseguita dall’inizio dell’aorta ascendente fino al primo ramo intercostale (Figura 2A). Utilizzare la funzione di quantificazione dell’area nel software per circondare manualmente l’area totale dell’arco intima.NOTA: La quantificazione della lesione deve essere eseguita in modo cieco ed è consigliabile che un secondo investigatore confermi i risultati. In ImageJ, selezionate lo strumento di selezione poligono e circondate l’area totale dell’arco con clic ripetitivi. Selezionare quindi misura nel menu Analizza per visualizzare l’area totale dell’arco nella finestra dei risultati. Successivamente, circonda tutte le placche in Sudan IV macchiate nell’arco. Sudan IV è un colorante diazo lisomatico che macchia lipidi, trigliceridi e lipoproteine di colore rosso-arancio. In ImageJ, selezionate lo strumento di selezione a mano libera e circondate tutte le placche tenendo premuto il tasto Alt. Fare clic su misura nel menu Analizza per visualizzare l’area dell’arco senza lesione nella finestra dei risultati. Calcolare l’area relativa della lesione sottraendo l’area senza lesione dall’area totale dell’arco e quindi dividendo il risultato con l’area totale dell’arco. Pin con attenzione le arterie subclaviane e carotide per consentire la quantificazione delle lesioni nell’arteria brachiocefalica (Figura 2A). La quantificazione delle lesioni nelle arterie subclaviane e nelle arterie carotidee comuni è di solito molto impegnativa e non significativa, rispettivamente. In ImageJ, circondare entrambi i pezzi dell’arteria braciocefalica utilizzando lo strumento di selezione del poligono mentre si preme il tasto Maiusc. Fare clic su misura nel menu Analizza per visualizzare l’area totale dell’arteria brachiocefalica nella finestra dei risultati. Quindi, selezionare lo strumento di selezione a mano libera e circondare tutte le placche nell’arteria brachiocefalica mentre si preme il tasto Alt. Fare clic su misura nel menu Analizza per visualizzare l’area dell’arteria brachiofalica senza lesione nella finestra dei risultati. Calcolare l’area relativa della lesione sottraendo l’area senza lesione dall’area totale dell’arteria brachiocefalica e quindi dividendo il risultato con l’area totale dell’arteria brachiocefalica. Figura 2: Quantificazione delle lesioni atherosclerotiche. (A) Arco aortico di un APOB100-Transgenico Ldlr-/- (HuBL) nutrito dieta occidentale per dieci settimane appuntato aperto e macchiato per placche ricche di lipidi con Sudan IV. L’area totale della superficie dell’arco aortico è delineata con la linea tratteggiata in bianco nel micrografo, barra della scala – 2 mm. Le linee tratteggiate in giallo delineano la superficie totale dell’arteria brachiocefalica. (B) Sezione trasversale della radice aortica a 400 m dal sinus aortico in una dieta occidentale maschio di 20 settimane alimentata con topo per otto settimane visualizzata in un micrografo, Scale Bar – 500m. Le linee tratteggiate in nero delineano l’area totale del vaso e le lesioni aterosclerotiche macchiate con Olio Rosso O localizzato nell’intima arteriosa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. Criosezione della Radice Aortica Impostare la temperatura criostat a -20 gradi centigradi e lo spessore della sezione su 10 m. Montare il blocco dello STRUMENTO di gravazione contenente la radice aortica sul supporto del provino con il tessuto ventricolare rivolto verso l’esterno. Mentre si inizia a tagliare, regolare l’allineamento della superficie della sezione in modo che sia parallelo al supporto del campione. Rimuovere l’eccessivo Oct circostante per facilitare la raccolta delle sezioni senza pieghe. La radice aortica dovrebbe ora essere posizionata perpendicolare alla lama del coltello dato che la base del cuore è stata posizionata correttamente nello stampo. Raccogliere le sezioni di controllo iniziali sui vetrini ordinari del microscopio, che verranno scartati. Le prime sezioni dovrebbero contenere solo tessuto muscolare cardiaco. Progredisci la sezionamento di 200 m all’epoca. Raccogliere una sezione e controllare i progressi con un microscopio luminoso. Quando ci si avvicina al tratto di deflusso del ventricolo sinistro, controllare ogni 100 m al microscopio. Quando si osservano le indicazioni iniziali di una parete del vaso, rallentare il ritmo a 50 m. NOT:</ Quando appare la prima cuspide aortica, questo sarà il punto zero per la raccolta delle sezioni. Può essere difficile vedere quando i cuspidi appaiono esattamente, ma una localizzazione esatta è fondamentale per eseguire confronti di lesioni nella stessa regione. Inclinare il campione verso la cuspide punto zero per allineare il piano di sezione con le altre due cuspidi. Questo è fondamentale per ottenere vere sezioni trasversali dell’aorta. Creare un disegno della radice aortica, indicando le cuspidi così come appaiono, e contare ogni sezione di 10 m che vengono tagliate dal punto zero in poi. Quando appare una seconda cuspide, inclinare leggermente il campione lontano dalla cuspide per allineare il campione con la terza cuspide. La differenza di livello tra le cuspidi non deve superare i 50 m. Iniziare a raccogliere sezioni sui vetrini dal livello 90 m e in poi. Raccogliere sezioni in base alla pianificazione delle diapositive nella Figura 3. La raccolta di sezioni può essere avviata da 190 m se la radice aortica è inclinata più di 50 m, per consentire ulteriore spazio per allineare la radice in posizione dritta. Continuare a sezionare fino a raggiungere il livello 800 m dal punto zero. Se ci sono ancora placche visibili a questo livello, la collezione potrebbe essere espansa a 1.000 m. NOT:</ Un’organizzazione di diapositive semplificata è presentata nella figura supplementare 1, che potrebbe aumentare la velocità di sezionamento. La pianificazione ottimale delle diapositive deve essere decisa in base al piano del progetto. Correggere le sezioni dopo la raccolta. Fissare le sezioni raccolte per l’olio rosso O colorazione e Picrosirius rosso colorazione di collagene in 4% formaldeide per 10 m. Risciacquare in acqua deionizzata, asciutto, e conservare a temperatura ambiente fino a perseguire con la sezione 4 in questo protocollo. Se gli scivoli devono essere macchiati con Olio Rosso O subito e sono ancora bagnati, metterli nel 60% isopropanol per 1 min per accelerare il processo di essiccazione.ATTENZIONE: Isopropanol è un liquido infiammabile che potrebbe causare gravi irritazioni agli occhi e può causare sonnolenza o vertigini. Conservare in un luogo ben ventilato e adottare misure precauzionali durante la manipolazione. Fissare le sezioni raccolte per l’immunosofochimica o l’immunofluorescenza nell’acetone puro freddo ghiaccio per 10 min. Secco a temperatura ambiente per 30 min. Memorizzare le sezioni in -20 gradi centigradi. Figura 3: Organizzazione delle diapositive per le sezioni seriali della radice aortica. Durante la criosezione della radice aortica ogni 10 m di sezione di spessore che si estende per i primi 800 m dell’aorta ascendente devono essere raccolti. È necessaria un’organizzazione sistematica di diapositive per ottenere sezioni idonee per varie applicazioni. L’analisi della composizione delle lesioni di solito include la colorazione O rossa dell’olio per i lipidi e la colorazione rossa Picrosirius per il collagene. Le sezioni rimanenti vengono raccolte e fissate con acetone per l’immunostochimica e la colorazione immunofluorescenza. Questa cifra è stata modificata da Gister et al30. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 4. Olio Rosso O Colorazione e Quantificazione dell’aterosclerosi nelle radici aortiche Preparare una soluzione O-Ora rossa satura sciogliendo 1 g di Olio Rosso O in 100 mL di isopropanolo. Mescolare la soluzione in una bottiglia scura per 1 ora a temperatura ambiente. La soluzione satura può essere conservata per diversi mesi. NOT:</ Si consiglia di disporre di attrezzature di laboratorio designate per la colorazione Oil Red O poiché è difficile pulire le apparecchiature che sono state a contatto con la soluzione. Preparare una soluzione di lavoro mescolando 75 mL della soluzione O rossa ad olio satura con 50 mL di acqua deionizzata. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 10 min. Filtrare attraverso una carta da filtro qualitativa. Mettere i vetrini nella soluzione di lavoro Oil Red O per 20 min. Per facilitare la visualizzazione dei tessuti, macchia con l’ematossia di Mayer per 1 min. Tutti i nuclei dovrebbero ora essere macchiati di colore blu, regolare il tempo di colorazione per ottimizzare il risultato. Montare i vetrini in un mezzo di montaggio acquoso (ad esempio, la gelatina di glicerolo di Kaiser). La gelatina di glicerolo di Kaiser calda a 40 gradi centigradi per renderla fluida prima dell’uso. Non è necessario asciugare i vetrini poiché il supporto di montaggio è a base d’acqua. Fare attenzione a evitare la formazione di bolle d’aria quando si aggiunge il vetro di copertura.ATTENZIONE: La gelatina di glicerolo di Kaiser contiene fenolo, che è sospettato di causare difetti genetici. Utilizzare dispositivi di protezione personale come richiesto. Acquisire micrografie digitali utilizzando una fotocamera collegata a un microscopio luminoso. Di solito la parete completa del vaso e i confini delle lesioni potrebbero essere chiaramente visualizzati con un ingrandimento di 50 volte. Salvare immagini ad alta risoluzione, preferibilmente in formato TIFF (Tagged Image File Format). Eseguire l’analisi delle dimensioni della lesione utilizzando un sistema software di analisi delle immagini assistito da computer. Olio Rosso O è un coloranti diazo lisocromo che macchia i lipidi neutri e visualizza le placlache aterosclerotiche con un colore rosso intenso, che aiuta la quantificazione delle lesioni.NOTA: La quantificazione della lesione deve essere eseguita in modo cieco ed è consigliabile che un secondo investigatore confermi i risultati ottenuti. Utilizzare la funzione di quantificazione dell’area nel software di analisi delle immagini per definire l’area totale del recipiente circondando la lamina elastica esterna della parete aortica del recipiente (Figura 2B). In ImageJ, selezionate lo strumento di selezione poligono e circondate l’area con clic ripetitivi. Quindi selezionare misura nel menu di analisi. L’area totale della nave viene visualizzata nella finestra dei risultati. Continuare a quantificare le lesioni aterosclerotiche nello strato intimido del vaso, definite dalla lamina elastica interna e dal confine luminale. Di solito le lesioni sui cuspidi valvolari sono escluse dalla misura27. In ImageJ, selezionate lo strumento di selezione a mano libera e circondate tutte le placche tenendo premuto il tasto Alt. Selezionare la misura nel menu Analizza per visualizzare l’area della nave priva di lesione nella finestra dei risultati. Calcolare l’area relativa della lesione sottraendo l’area libera dalla lesione totale e quindi dividendo il risultato con l’area totale della nave. NOT:</ Calibrare i risultati nel software di analisi delle immagini in base all’ingrandimento utilizzato per ottenere un’area di lesione assoluta in micrometro quadrato. Definire l’area oil Red O-colorato nelle lesioni utilizzando una funzione di soglia del colore nel software di analisi delle immagini per calcolare la percentuale di area positiva O O Rosso Olio dell’area di lesione totale. In ImageJ, circondatutta l’area di lesione utilizzando lo strumento di selezione a mano libera mentre premi il tasto Maiusc. Selezionare misura nel menu Analizza per visualizzare l’area di lesione totale nella finestra dei risultati. Selezionare Cancella all’esterno nel menu di modifica. Impostare il tipo di immagine su 8 bit nel menu immagine. Impostare una soglia rossa per l’area negativa O O rosso olio selezionando soglia nel sottomenu regola del menu immagine. Fare clic su Applica. Rendere l’immagine binaria selezionando questa opzione nel sottomenu binario del menu di elaborazione. NOT:</ Di solito l’olio Red O colorazione varia tra i lotti. Di conseguenza, la soglia dei colori è consigliata solo all’interno dello stesso batch di colorazione. Il risultato dovrebbe essere presentato insieme a una descrizione di come la soglia è stata determinata e standardizzata. Analizzare l’immagine selezionando Analizza particelle nel menu Analizza e fare clic su OK. L’area di lesione negativa Total Oil Red O viene ora visualizzata nella finestra di riepilogo. Calcolare l’area positiva O Rossa O dell’Olio relativa sottraendo l’area negativa O Rossa dell’Olio dall’area di lesione totale e quindi dividendosi con l’area di lesione totale.

Representative Results

Nei modelli murini di aterosclerosi le lesioni più evidenti tendono a svilupparsi nella radice aortica e nell’arco aortico. Questo protocollo descrive la quantificazione dell’aterosclerosi nella radice aortica, nell’arco aortico e nell’arteria brachiocefalica in un singolo topo. Le lesioni misurabili nell’aorta discendente toracica e nell’aorta addominale sono presenti solo negli animali con malattia avanzata. In questo protocollo, queste parti non vengono analizzate per l’onere aterosclerotico, ma salvate per la successiva analisi dei livelli di mRNA o di altre analisi. Le sezioni seriali di lesioni aterosclerotiche nella radice aortica vengono solitamente visualizzate in un grafico con dimensioni di lesione sull’asse ye distanza dal seno aortico sull’asse x28. Le vere sezioni trasversali sono fondamentali per la quantificazione delle dimensioni della lesione. Le sezioni oblique possono sopravvalutare le dimensioni delle lesioni e un’inclinazione di soli 20 gradi potrebbe sopravvalutare la superficie di lesione assoluta del 15. Tuttavia, il calcolo della frazione di lesione dell’area totale della nave rende il risultato meno sensibile alle possibili differenze di angolo durante la sezionamento (Figura 4A). Un metodo statistico appropriato per rilevare le differenze tra i gruppi è in genere un’analisi regolare bidirezionale della varianza (ANOVA). I post-test di Bonferroni vengono quindi effettuati per rilevare le differenze a determinati livelli. La differenza meno significativa di Fisher potrebbe essere utilizzata anche come test di follow-up di ANOVA. Riduce la probabilità di errori statistici di tipo II, ma non tiene conto di più confronti. Inoltre, potrebbe essere esemplificativo calcolare l’area sotto la curva o la dimensione media della lesione per mouse e presentare i dati in un grafico a punti per visualizzare ulteriormente la variazione individuale all’interno dei gruppi (Figura4B). Olio Rosso O è un coloranti rosso brillante grasso, che macchia i lipidi neutri. I lipidi polari nelle membrane cellulari non sono macchiati. La colorazione O rossa dell’olio può essere eseguita su campioni freschi, congelati o fissati in formalina, ma non su campioni incorporati in paraffina a causa della rimozione dei lipidi nel processo di deparaffinazione richiesto. Una quantificazione dell’accumulo di lipidi lesionali potrebbe essere eseguita sotrivestita dal colore dell’area positiva O rosso olio della superficie di lesione totale (Figura 4C). L’ematossina produce una colorazione blu dei nuclei cellulari, che è utile per visualizzare la morfologia della placca. Le arterie coronarie destra e sinistra di solito divergono dall’aorta a circa 250 m dal sole aortico27, che spesso coincidono con le dimensioni di lesione più prominenti. Le sezioni trasversali di questa area vengono spesso visualizzate come risultati rappresentativi (Figura 4D). Figura 4: Lesioni aterosclerotiche nella radice aortica. (A) Sono state valutate le chimere di midollo osseo maschio di 28 settimane alimentate per la dieta occidentale per otto settimane per determinare l’effetto delle cellule T carenti di Smad7sullo sviluppo dell’aterosclerosi. Gli studi sperimentali Ldlr-/- hanno ricevuto il midollo osseo Cd4-Cre-Smad7e i controlli sono stati ricevuti per il midollo osseo Cd4-Cree Smad7. Il grafico mostra la quantificazione dell’area di lesione aterosclerotica da otto sezioni consecutive, 100 – 800 m dal sinus aortico visualizzato come frazione di lesione della superficie totale del vaso (Cd4-Cre n-6, Cd4-Cre-Smad7fl/fl/Ldlr-/- n – 9, ANOVA a 2 vie con il post test di Bonferroni, il grafico mostra il significato di SEM, le parentesi graffe indicano il livello di significatività per il confronto delle deformazione). (B) Il grafico a punti combinati e il grafico a barre mostra l’area di lesione atheroscleroticerotica media dalle sezioni radice aortiche (Cd4-Cre Ldlr-/- n – 9, Studente-test) (C) Frazione dell’area color O rossa dell’olio nelle lesioni (Cd4-Cre,Smad7fl // / Ldlr-/- n – 4, Cd4-Cre /Ldlr-/- n – 6, I punti t-test, ns, non significativi) (B-C) rappresentano i singoli topi e le singole barre che mostrano micrografie rappresentative della media (D ) che mostrano la colorazione Oil Red O (in rosso colore) dei lipidi neutri nella radice aortica 300 m dal seno aortico (ingrandimento 50x), barra della scala : 500 , m. , 0,05,p , 0,001. Questa cifra è stata modificata dal Gister àt al.31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Olio Rosso O potrebbe essere utilizzato per la colorazione di en face predisposto aortas, ma questo protocollo utilizza Sudan IV, un altro comodo colorante diazo solubile in grasso. Sudan IV visualizza chiaramente le placche aterosclerotiche in un colore rosso-arancio macchiando lipidi, trigliceridi e lipoproteine. La rimozione dello sfondo scuro in immagini rappresentative degli archi aortici en face potrebbe migliorare la visualizzazione (Figura 5A). Di solito le dimensioni della lesione sono normalmente distribuite all’interno di gruppi, consentendo test statistici con il test t-tra i gruppi di Student. Un grafico a punti che mostra sia i singoli topi che la media, che viene confrontata tra i gruppi, è un modo informativo per visualizzare i risultati (Figura 5B-C). Poiché la variazione all’interno dei gruppi è in genere diversa tra le posizioni nell’albero vascolare, di solito sono necessari calcoli di potenza separati. Variazioni non necessarie possono essere evitate dalla competenza del metodo e dalla standardizzazione del protocollo. Ottenere risultati statisticamente significativi è importante, ma la rilevanza biologica per una differenza osservata deve sempre essere considerata anche. Figura 5: Lesioni aterosclerotiche nell’arco aortico e nell’arteria brachiocefalica. (A) Rappresentante faccia micrografie di archi aortici con placche cariidi macchiati con Sudan IV (in colore arancione) da 20 settimane vecchi topi nutriti dieta occidentale per dieci settimane, visualizzati insieme. I topi a 2 mm- Human APOB100-transgenic Ldlr-/- (HuBL) sono stati utilizzati come controlli e il gruppo sperimentale era costituito da topi transgenici TCR con cellule T lDL-reattive (BT1) incrociate a topi HuBL. (B) Lesioni aterosclerotiche nell’arco aortico (HuBL n – 10, BT1xHuBL n – 12; Test tdello studente). (C) Lesioni aterosclerotiche nell’arteria brachiocefalica (HuBL n – 8, BT1xHuBL n – 9, Test tdello studente). (B-C) I punti rappresentano i singoli topi, le barre mostrano la media di ,SEM. Questa cifra è stata modificata da Gister et al.32. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 1: Organizzazione alternativa delle diapositive per le sezioni seriali della radice aortica. Un’organizzazione sistematica di diapositive semplificata per la raccolta di sezioni dalla radice aortica. La collezione abilita la colorazione ORossa dell’olio per i lipidi e l’immunohistochimica o l’colorazione immunofluorescenza. Vengono omesse diapositive dedicate per la colorazione rossa Picrosirius di collagene. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

La malattia cardiovascolare è il principale killer al mondo e sono necessarie nuove misurazioni preventive2. I modelli murini della malattia forniscono una piattaforma completa per lo studio della fisiopatologia e dei trattamenti sperimentali13. Per questo approccio è essenziale una quantificazione affidabile delle dimensioni delle lesioni. Tuttavia, i metodi di quantificazione differiscono tra i laboratori. La standardizzazione e l’ottimizzazione sono un processo continuo dagli anni ’8013,27,33,34. Le radici aortiche sono emerse come il sito più popolare per quantificare l’aterosclerosi sperimentale. Le sezioni trasversali delle placche consentono di confrontare il volume della placca tra i gruppi. I preparatici viso sono favoriti per la quantificazione della lesione in segmenti più grandi dell’aorta. Il metodo en face visualizza la quantità di placche e consente la quantificazione della copertura della zona della placca, ma non tiene conto dello spessore della placca. La rilevanza biologica per le differenze osservate è corroborata da risultati coerenti in diverse posizioni dell’albero vascolare. La valutazione dello sviluppo dell’aterosclerosi in diverse posizioni affronta i possibili effetti specifici del sito. L’effetto delle cellule ematopoietiche trapiantate sullo sviluppo aterosclerosi può essere valutato nelle chimere ipercolesterolemiche Ldlr-/-. Tuttavia, l’irradiazione di tutto il corpo influisce sul processo di aterosclerosi con effetti specifici del sito. Le lesioni aterosclerotiche più prominenti sono sviluppate nella radice aortica, mentre lo sviluppo ridotto delle lesioni è osservato negli archi aortici35.

È importante sottolineare che non solo le dimensioni della lesione devono essere affrontate negli studi sull’aterosclerosi sperimentale. La composizione della lesione è anche un parametro chiave. Diverse caratteristiche di placca sono state associate con manifestazioni della malattia in esseri umani36. La sezionamento seriale della radice aortica lascia diverse sezioni disponibili per un’attenta analisi della composizione della placca. La rottura della placche negli esseri umani è caratterizzata da un sottile tappo fibroso con poche cellule muscolari lisce, contenuto di collagene sparse e segni di infiammazione nelle placche36. Anche se la rottura della placca è un evento raro nei modelli murini di aterosclerosi, i marcatori per la stabilità della placca sono informativi per valutare. Gli approcci traslazionali potrebbero confermare i risultati meccanicistici dei modelli murini e scoprire importanti caratteristiche della malattia umana31. Lo stato infiammatorio delle placche aterosclerotiche potrebbe essere determinato dalla colorazione immunohistochimica di VCAM-1, MHC di classe II, macrofagi e linfociti30. Alcuni protocolli utilizzano sezioni longitudinali nel piano coronale dell’arco aortico o dell’arteria brachiocefalica per misurare le dimensioni della lesione atesclerotica e la composizione37. Tuttavia, questo metodo alternativo lascia solo poche sezioni da analizzare, il che limita le sue applicazioni.

Un primo passo critico in questo protocollo è la capacità di raccogliere le aortas in modo efficiente. La coordinazione occhio-mano al microscopio richiede pratica ed è fondamentale sia per la microdissezione che per la successiva puntura dell’arco aortico. Il successivo passaggio critico di questo protocollo è la raccolta di sezioni seriali dalla radice aortica. Ottanta sezioni consecutive dovrebbero essere raccolte per ogni mouse, che richiede sia la messa a fuoco e la pazienza. La competenza metodologica potrebbe accelerare notevolmente i processi descritti. Tuttavia, la quantificazione della lesione aterosclerotica è ancora un compito che richiede molto tempo. La nuova tecnologia, la manipolazione automatizzata e l’imaging di piccoli animali potrebbero facilitare la quantificazione dell’aterosclerosi sperimentale in futuro. La progressione dell’aterosclerosi è lenta e la maggior parte dei protocolli sperimentali nei modelli murini richiede più di quattro mesi per essere completata13. Pertanto, le aortas devono essere raccolte in modo ottimizzato agli endpoint di studio. Questo protocollo fornisce una guida completa per raccogliere le aortas in modo efficiente e l’elaborazione proposta prepara le aortas per l’uso multiuso, tra cui la quantificazione delle lesioni nella radice aortica, nell’arco aortico e nell’arteria brachiocefalica. Speriamo che il protocollo possa ridurre la variabilità sperimentale, migliorare l’affidabilità dei risultati e portare a risultati che spianeranno la strada a nuovi trattamenti contro l’aterosclerosi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo tutti i membri del passato dell’unità sperimentale di ricerca cardiovascolare di Gàran K Hansson che ha contribuito a sviluppare questo protocollo nel corso dell’ultimo quarto di secolo. Siamo particolarmente grati per i contributi di Antonino Nicoletti, Xinghua ‘hou, Anna-Karin Robertson e Inger Bodin. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del progetto 06816 e Linnaeus sostiene 349-2007-8703 del Consiglio svedese della ricerca, e da sovvenzioni della Fondazione svedese cuore-polmone, del consiglio della contea di Stoccolma, della fondazione professor Nanna Svartz, Loo e Hans Osterman Fondazione per la ricerca medica, Fondazione di ricerca del Karolinska Institutet e Fondazione per le malattie geriatriche presso Karolinska Institutet.

Materials

Acetone VWR Chemicals 20066.296 For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide) Any specialized retailer – To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge Eppendorf 5417C Benchtop microcentrifuge.
Cork board Any specialized retailer – For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat Thermo Scientific Microm HM 560 For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water – – For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera Leica Microsystems DC480 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight) World Precision Instruments 14393 For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) World Precision Instruments 500341 For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v) VWR Chemicals 83801.290 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8% VWR Chemicals 20821.310 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) VWR Chemicals 9713.1000 Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ NIH – Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) World Precision Instruments 15915-G Used as anatomical forceps.
Isopropanol Merck 1096341011 Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine Merck 1092420100 Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope Leica Microsystems DM LB2 For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin Histolab 1820 Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight) World Precision Instruments 501751-G For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) World Precision Instruments 503376 For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes Corning MCT-175-C Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge BD 300800 For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge BD 302200 For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA Sarstedt 20.1341.100 For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin Sarstedt 20.1345.100 For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10 For pinning of aortic arches.
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount Histolab 45830 For embedding tissue.
Parafilm M Bemis PM992 Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100×20 mm) Any cell culture supplier – Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS) – – Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001) Munktell 120006 For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76106 For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm) World Precision Instruments 500236 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10 World Precision Instruments 500239 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope Leica Microsystems MZ6 For dissection and en face documentation
Sudan IV Sigma-Aldrich S4261 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm) World Precision Instruments 501741-G For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) Sakura 4565 For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight) World Precision Instruments 503378 For microdissection of aorta.
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Centa, M., Ketelhuth, D. F., Malin, S., Gisterå, A. Quantification of Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (148), e59828, doi:10.3791/59828 (2019).
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